系統(tǒng)性紅斑狼瘡P糖蛋白基因多態(tài)性及血清糖蛋白糖基化修飾的研究及意義.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 P糖蛋白基因多態(tài)性與廣西地區(qū)系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究
　　目的：P糖蛋白表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生、發(fā)展及治療等方面有關(guān)，MDR1基因是P糖蛋白編碼基因，本部分研究P糖蛋白(P-gp) MDR1基因rs1128503和rs1045642單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)在廣西地區(qū)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者及健康人群中的基因分布及頻率，探討rs1128503和rs1045642

2、位點(diǎn)基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡遺傳易感性的關(guān)系，從基因水平為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制及靶向治療等方面研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，發(fā)掘與糖蛋白相關(guān)的SLE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遺傳標(biāo)記。
　　方法：收集來自廣西地區(qū)的283例SLE確診患者為病例組，選取251例健康體檢者作為對(duì)照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)MDR1基因rs1128503和rs1045642位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組的基因分布頻率，用DNA測(cè)序法測(cè)定對(duì)應(yīng)基因

3、序列，以Hardy-Weinberg平衡(HWE)定律檢驗(yàn)納入病例的群體代表性及可比性。SNP等位基因及基因型的分布差異用x2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，SNP多態(tài)性與SLE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系用logistic回歸方法分析。
　　結(jié)果：兩組在性別和年齡構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。經(jīng)HWE定律檢驗(yàn)，兩組基因頻率符合遺傳平衡，具有群體代表性。rs1128503位點(diǎn)基因型分布頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，等位基因分布頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

4、P＜0.05)。以對(duì)照組為參照，通過logistic回歸分析校正性別及年齡因素，計(jì)算SLE組與對(duì)照組的比值比(OR)值。
　　結(jié)論：P糖蛋白MDR1基因rs1128503位點(diǎn)的T等位基因和純合子突變TT基因型可能與廣西地區(qū)人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有正相關(guān)關(guān)系，尤以40歲及以上人群顯著。
　　第二部分 系統(tǒng)性紅斑狼瘡不同活動(dòng)期血清糖蛋白糖譜差異研究及意義分析
　　目的：系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一類與免疫功能密切相關(guān)的自身免疫

5、病，免疫反應(yīng)的異常涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病、進(jìn)展、療效及預(yù)后。蛋白質(zhì)糖基化修飾是一種常見的翻譯后修飾，在免疫細(xì)胞粘附、信號(hào)傳導(dǎo)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、受體構(gòu)成、細(xì)胞分化發(fā)育及免疫調(diào)控等方面均有重要作用。本部分研究應(yīng)用凝集素集合芯片技術(shù)對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡不同活動(dòng)期患者血清樣本進(jìn)行分析，旨在研究其糖蛋白糖譜特征性變化，篩選系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及活動(dòng)分期相關(guān)特征性糖譜標(biāo)志，為進(jìn)一步診療研究提供思路及基礎(chǔ)。
　　方法：采用凝集素芯片技術(shù)檢測(cè)血清低豐度蛋白糖

6、鏈親和信號(hào)，主要包含以下步驟:(1)待測(cè)樣本預(yù)處理:等體積混合4組（健康對(duì)照組、活動(dòng)期初診組、活動(dòng)期治療組及非活動(dòng)期組）患者血清，使用高豐度蛋白去除柱收集血清低豐度蛋白;(2)收集的低豐度蛋白經(jīng)除鹽、測(cè)定濃度后置換為標(biāo)記緩沖液;(3)待測(cè)蛋白用Lightning-Link法進(jìn)行生物素標(biāo)記;(4)生物素標(biāo)記待測(cè)蛋白與凝集素芯片進(jìn)行雜交及Cy5熒光標(biāo)記;(5)芯片掃描、數(shù)據(jù)提取;(6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以SPSS16.0進(jìn)行，方差齊者用單因素方差分析

7、，以Student-Newman-Keuls(S-N-K)檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，方差不齊者用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果：本次研究中，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)芯片數(shù)據(jù)變異系數(shù)基本滿足片內(nèi)小于15％，片間小于20％。4組樣品中共篩選出20種有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的凝集素陽性親和信號(hào)，分別是AAL、HAL、PSA、RCA60、SNA、EEL、LEL、 NML、VAL、CFL、ConA、JAC、MPL、PCL、PHA-E、MAL-Ⅰ、HHL、LCA、 RCA-Ⅰ、S

8、TL。其中AAL、HAL、PSA、RCA60及SNA親和信號(hào)在SLE活動(dòng)期初診組較健康對(duì)照組顯著減弱（P＜0.05），提示SLE活動(dòng)期初診組的血清糖蛋白糖鏈譜中末端巖藻糖、唾液酸化路易斯抗原、N-乙酰半乳糖胺、α連接甘露糖、α2，6連接唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)表達(dá)減少。而經(jīng)治療的活動(dòng)期治療組和非活動(dòng)期組與初診組相比，上述5種凝集素親和信號(hào)顯著上升(P＜0.05)，提示上述相對(duì)應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)合成較初診組增加，基本恢復(fù)到健康對(duì)照組水平。EEL、LEL及

9、NML凝集素親和信號(hào)在活動(dòng)期初診組較對(duì)照組明顯增高(P＜0.05)，提示活動(dòng)期初診組的血清糖蛋白α1，3連接半乳糖、N-乙酰氨基葡糖、高甘露糖結(jié)構(gòu)顯著增多。而活動(dòng)期治療組和非活動(dòng)期組水平與對(duì)照組相近，提示經(jīng)治療后對(duì)應(yīng)糖鏈結(jié)構(gòu)表達(dá)較初診組減低，基本恢復(fù)到或略低于健康對(duì)照組水平。
　　結(jié)論：各種凝集素親和信號(hào)變化趨勢(shì)各有不同，表示SLE治療過程中不同活動(dòng)期血清糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)變化的復(fù)雜性與特異性，這提示以SLE不同活動(dòng)期血清特征性糖譜作

10、為疾病活動(dòng)度分期生物標(biāo)志具備一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。SLE初診期血清糖蛋白結(jié)構(gòu)中末端巖藻糖、唾液酸化路易斯抗原、N-乙酰半乳糖胺、僅連接甘露糖及α2，6連接唾液酸結(jié)構(gòu)合成明顯減少，α1，3連接半乳糖、N-乙酰氨基葡糖、高甘露糖結(jié)構(gòu)合成增多，而經(jīng)治療后，這些糖鏈結(jié)構(gòu)的合成逐漸恢復(fù)至接近正常水平。提示這些糖鏈結(jié)構(gòu)表達(dá)水平變化可能與SLE發(fā)病機(jī)制或疾病活動(dòng)進(jìn)展有關(guān)。
　　第三部分 系統(tǒng)性紅斑狼瘡不同活動(dòng)期血清糖蛋白糖譜差異免疫驗(yàn)證
　　目

11、的：凝集素作為糖的“解碼器”在糖組學(xué)和糖蛋白組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。但與抗原抗體反應(yīng)相比，凝集素與糖鏈結(jié)構(gòu)結(jié)合的親和性和特異性仍是其相關(guān)技術(shù)的“瓶頸”。在本部分研究中，我們以凝集素芯片檢測(cè)同批血清樣本及按相同納入標(biāo)準(zhǔn)收集的另批次血清樣本為研究對(duì)象，采取凝集素免疫印跡技術(shù)對(duì)凝集素芯片結(jié)果進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，以提高芯片結(jié)果的可靠性。
　　方法：選取凝集素芯片檢測(cè)同批混合血清樣本及按相同納入標(biāo)準(zhǔn)收集的另批次血清樣本為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)步驟主要包括:(

12、1)制備混合血清樣本與富集血清低豐度蛋白，測(cè)定蛋白濃度后備用;(2)待測(cè)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜;(3) PVDF膜與生物素標(biāo)記凝集素雜交后，進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記;(4)利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)標(biāo)記凝集素蛋白條帶;(5)結(jié)果掃描及Quantity One軟件分析。
　　結(jié)果：以凝集素芯片檢測(cè)同批混合血清及另批次血清進(jìn)行凝集素免疫印跡驗(yàn)證，選擇SNA、ConA、PHA-E、LCA、PSA及AA

13、L6種凝集素進(jìn)行，膜條結(jié)果用Bio-rad公司的Quantity One軟件進(jìn)行分析，以蛋白條帶灰度值總和代表?xiàng)l帶的強(qiáng)度，即相應(yīng)糖鏈結(jié)構(gòu)的水平。驗(yàn)證結(jié)果以條帶灰度柱形圖表示，結(jié)果顯示:同批混合血清凝集素驗(yàn)證結(jié)果變化趨勢(shì)基本與凝集素芯片結(jié)果一致;另批次血清凝集素驗(yàn)證結(jié)果變化趨勢(shì)大部分與芯片結(jié)果相符，PHA-E驗(yàn)證結(jié)果中非活動(dòng)期組蛋白條帶灰度較弱，與初診組相近，這與芯片結(jié)果比較有偏差。兩批次驗(yàn)證條帶整體強(qiáng)度與芯片熒光強(qiáng)度結(jié)果有所差異。

14、>　　結(jié)論：兩批次血清樣本凝集素免疫印跡驗(yàn)證結(jié)果大部分與凝集素芯片結(jié)果相一致，可以基本證實(shí)本次研究凝集素芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。新批次驗(yàn)證結(jié)果中PHA-E凝集素組的不一致性可能與個(gè)體差異、批間誤差等因素有關(guān)。具體仍有待進(jìn)一步研究。兩批次驗(yàn)證結(jié)果都存在印跡條帶強(qiáng)度與芯片熒光強(qiáng)度不完全一致的現(xiàn)象，原因可能由驗(yàn)證凝集素的稀釋度不同或方法學(xué)差異所致。
　　第四部分 靜注唾液酸化免疫球蛋白與系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療有效性的循證醫(yī)學(xué)研究

15、　　背景和目的：靜注免疫球蛋白近年來逐漸用以治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡，其機(jī)制與IgG分子連接的糖鏈結(jié)構(gòu)α2，6唾液酸有關(guān)。但是，靜注免疫球蛋白對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡療效的影響在已發(fā)表文獻(xiàn)中報(bào)道并非完全一致。因此，我們以臨床隨機(jī)研究為對(duì)象，采用循證醫(yī)學(xué)研究方法探討糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑聯(lián)合靜脈注射唾液酸化免疫球蛋白治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的效果。
　　方法：通過計(jì)算機(jī)檢索PubMed、EMBASE、Cochrane圖書館等外文數(shù)據(jù)庫以及中國知網(wǎng)、中國

16、生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)、萬方、維普等中文數(shù)據(jù)庫，查找糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑聯(lián)合靜注唾液酸化免疫球蛋白治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)（文獻(xiàn)發(fā)表于2015年2月10日之前），對(duì)入選研究進(jìn)行篩選、資料提取，臨床緩解率、系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)、補(bǔ)體C3血清學(xué)變化、24小時(shí)蛋白尿、院內(nèi)感染率等具體指標(biāo)直接或間接由最終納入文獻(xiàn)提取或計(jì)算，并對(duì)文獻(xiàn)質(zhì)量按Jadad量表進(jìn)行評(píng)價(jià)，提取數(shù)據(jù)使用Stata12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行薈萃分析。
　　結(jié)果：檢索及篩

17、選后共納入5個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究，共237例患者，其中試驗(yàn)組115例，對(duì)照組122例。薈萃分析結(jié)果顯示:糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑聯(lián)合靜注唾液酸化免疫球蛋白組與對(duì)照組相比，提高SLE患者臨床緩解率(OR=2.99，95％CI=1.53-5.85，P=0.001)和降低院內(nèi)感染率(OR=0.26，95％CI=0.10-0.66，P=0.005)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但對(duì)降低狼瘡活動(dòng)指數(shù)SLEDAI評(píng)分(WMD=-1.80，95％CI=-3.96-0

18、.35，P=0.101)和24小時(shí)尿蛋白量(WMD=-1.09，95％CI=-2.20-0.03，P=0.056)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：目前基于臨床隨機(jī)研究的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，靜注射唾液酸化免疫球蛋白與激素、免疫抑制劑聯(lián)合治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡，對(duì)提高臨床緩解率和降低院內(nèi)感染發(fā)生率方面有積極作用，而對(duì)SLE活動(dòng)指數(shù)及24小時(shí)尿蛋白量的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一相關(guān)性有待更多的臨床研究證實(shí)，而免疫球蛋白唾液酸糖基化修飾對(duì)提高系統(tǒng)性紅