右美托咪啶預(yù)給藥對脂多糖誘發(fā)中樞炎性的影響及其機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分，免疫系統(tǒng)對LPS應(yīng)答產(chǎn)生過量細胞因子和炎性介質(zhì)，誘發(fā)全身炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素休克，可發(fā)展為膿毒血癥，甚至多器官功能障礙綜合征（multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)。膿毒性腦?。╯epsis-associatedencephalopathy，SAE）是一種常見的中樞炎性疾病，為感染

2、后全身炎癥反應(yīng)所致的彌漫性大腦功能障礙和意識改變，是多臟器功能不全綜合征（MODS）的重要組成部分及患者預(yù)后不良的獨立危險因素。SAE主要以白細胞浸潤、神經(jīng)元細胞變性壞死、星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞激活為標志的炎癥反應(yīng)為特點。其中，致炎介質(zhì)可激活膠質(zhì)細胞將產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-a(tumornecrosisfactor-a,TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素-6(interleuki

3、n-6，IL-6),同時促進誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(InducibleNitricOxideSynthase,iNOS)與環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）的表達，進而級聯(lián)產(chǎn)生大量的自由基損傷神經(jīng)細胞甚至死亡。
　　右美托咪啶是一種高選擇性α-2腎上腺素能受體（α-2adrenergicreceptors,α2-AR）激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗炎作用。研究表明，右美托咪啶抑制內(nèi)毒素暴露大鼠細胞因子的反應(yīng)，早期

4、使用能顯著性的降低死亡率。同時，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路及其下游轉(zhuǎn)錄因子-kappa（nuclearfactorkappa，NF-κb）廣泛介導(dǎo)體內(nèi)炎癥介質(zhì)的發(fā)生、發(fā)展過程，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKS)包括3個家族：ERK1/2、P38MAPK、JNK，三個亞通路獨自承載著特有生物信號的信息傳遞，同時又相互影響，復(fù)合完成精細的生物信號傳導(dǎo)，屬于信號分子并控制

5、著一系的生理過程。其中ERK1/2和P38MAPK信號通路與炎癥的調(diào)控關(guān)系最為密切，因此，本研究擬探討右美托咪啶對LPS誘導(dǎo)的中樞炎性影響及其與MAPK/NF-κb信號通路及其亞通路的相關(guān)性，為圍術(shù)期干預(yù)膿毒癥所致的中樞炎性病變提供一定的理論依據(jù)和治療思路。
　　第一部分、右美托咪啶預(yù)給藥對LPS誘發(fā)中樞炎性的影響
　　目的：
　　1、觀察右美托咪啶預(yù)給藥對LPS誘發(fā)大鼠外周炎性的影響。
　　2、觀察右美托嘧啶預(yù)

6、給藥對LPS誘發(fā)大鼠中樞炎性的影響。
　　材料與方法：
　　健康清潔級雌性SD大鼠40只，體重250g-300g。按隨機數(shù)字法分四組，每組10只，即對照組（NC組）、LPS組(L組）、DEX干預(yù)組（D+L)以及二甲基亞砜組（DMSO組）。NC組腹腔注射生理鹽水1ml；L組腹腔注射LPS(10mg/kg,稀釋到1ml)；DL組在給LPS前30min單次腹腔注射右美托咪啶（100μg/kg，稀釋到1ml)提前干預(yù)；DMSO組腹腔

7、注射2％DMSO1ml。標本取材均在最后一次腹腔注射給藥后6h，腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g麻醉大鼠，迅速開胸心臟取血和斷頭取海馬；提取器官標本后，分別進行蛋白印跡檢測（WesternBlot，WB）、酶聯(lián)免疫吸附檢測(Enzyme-linkedimmunesorbent,ELISA)、逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶反應(yīng)檢測（Reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-QPCR）。We

8、sternBlot蛋白印跡檢測海馬組織中的NF-κb、IΚB、IL-1、TNF-α、iNOS、COX-2表達；ELISA酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血血漿中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10的濃度；RT-QPCR檢測關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子NF-κb的mRNA表達。
　　結(jié)果：
　　1、外周血清ELISA:與NC組比較，L組的促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6表達顯著上升（P＜0.05),抗炎因子IL-10同樣顯著上升（P＜0.

9、05)。而與DL組比較，DL組的促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6表達顯著下降（P＜0.05),抗炎因子IL-10同樣顯著下降（P＜0.05)。
　　2、海馬組織Westernblotting：與NC組比較，L組的炎癥因子TNF-α、IL-1、iNOS及COX-2表達顯著上升（P＜0.05)，轉(zhuǎn)錄因子NF-κb顯著上升（P＜0.05)，抑制蛋白IΚB表達顯著下降（P＜0.05)。而與DL組比較，DL組的炎癥因子TNF-α、IL

10、-1、iNOS及COX-2表達顯著下降（P＜0.05)，轉(zhuǎn)錄因子NF-κb顯著下降（P＜0.05)，抑制蛋白IΚB表達顯著上升（P＜0.05)。
　　3、海馬組織RT-QPCR:與NC組比較，L組的轉(zhuǎn)錄因子NF-κb顯著上升（P＜0.05)。而與DL組比較，轉(zhuǎn)錄因子NF-κb顯著下降（P＜0.05)。
　　4、與NC組比較，DMSO組外周血清炎性指標和海馬炎性指標之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：

11、>　　1、右美托咪啶預(yù)給藥可改善LPS所誘導(dǎo)的外周炎性。
　　2、右美托咪啶預(yù)給藥可改善LPS所誘導(dǎo)的中樞炎性。
　　第二部分、右美托咪啶預(yù)給藥對LPS誘發(fā)中樞炎性的機制探討
　　目的：
　　1、探究DEX預(yù)給藥改善中樞炎性與ERK1/2MAPK/NF-κb通路的關(guān)系。
　　2、探究DEX預(yù)給藥改善中樞炎性與P38MAPK/NF-κb通路的關(guān)系。
　　材料與方法：
　　在第一部分實驗的基礎(chǔ)上，5

12、0只雌性SD大鼠,按隨機數(shù)字法分為5組，每組10只，即DMSO組、PL組(PD98059+LPS組）、PDL組（PD98059+DEX+LPS)、SL組（SB203580+LPS)和SDL組（SB203580+DEX+LPS)。DMSO組腹腔注射2%DMSO1ml；PL組腹腔注射PD98059（0.5mg/kg，溶解于1ml2%DMSO),5min后再次腹腔注射LPS(10mg/kg,稀釋到1ml)；PDL組單次腹腔注射PD98059（

13、0.5mg/kg，1ml2%DMSO溶解),5min后腹腔注射右美托咪啶（100μg/kg，稀釋到1ml)，30min后再次腹腔注射LPS(10mg/kg,稀釋到1ml);SL組單次腹腔注射SB203580（5mg/kg，1ml2%DMSO溶解),5min后再次腹腔注射LPS(10mg/kg,稀釋到1ml);SDL組單次腹腔注射SB203580（5mg/kg，溶解于1ml2%DMSO),5min后單次腹腔注射右美托咪啶（100μg/kg

14、，稀釋到1ml)，30min后再次腹腔注射LPS(10mg/kg,稀釋到1ml)。標本采集時間和方法、相應(yīng)的檢測指標和檢測方法同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1、外周血清ELISA:與DMSO組比較，PL、SL組的促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6表達顯著上升（P＜0.05),抗炎因子IL-10同樣顯著上升（P＜0.05)。而PL與PDL、SL與SDL組相比較，促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6表達顯著下降（P＜0.0

15、5),抗炎因子IL-10同樣顯著下降（P＜0.05)。
　　2、海馬組織Westernblotting：與DMSO組比較，PL、SL組的炎癥因子TNF-α、IL-1、iNOS及COX-2表達顯著上升（P＜0.05)，轉(zhuǎn)錄因子NF-κb顯著上升（P＜0.05)，抑制蛋白IΚB表達顯著下降（P＜0.05)。而PL與PDL、SL與SDL組相比較，炎癥因子TNF-α、IL-1、iNOS及COX-2表達顯著下降（P＜0.05)，轉(zhuǎn)錄因子NF

16、-κb顯著下降（P＜0.05)，抑制蛋白IΚB表達顯著上升（P＜0.05)。
　　3、海馬組織RT-QPCR:與DMSO組比較，PL、SL組的轉(zhuǎn)錄因子NF-κb顯著上升（P＜0.05)。而PL與PDL、SL與SDL組相比較，NF-κbmRNA表達顯著下降。
　　結(jié)論：
　　1、DEX預(yù)給藥通過抑制ERK1/2MAPK/NF-κb通路改善LPS所致中樞炎性。
　　2、DEX預(yù)給藥通過抑制P38MAPK/NF-κb通