尿毒癥毒素硫酸鹽對甲酚促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生及其毒性作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　慢性腎病（Chronic kidney disease，CKD）是心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）的重要危險因素之一。CVD病死率占到CKD患者全因死亡人數(shù)的40%～50%。CKD患者出現(xiàn)心力衰竭、缺血性心臟病等CVD并發(fā)癥與心室重構(gòu)、動脈粥樣硬化等基本病理改變密不可分。在CKD人群中，超過40%的患者出現(xiàn)左心室肥厚，并伴有心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變；動脈粥樣硬化的發(fā)生率也高達(dá)30

2、%，隨著腎臟功能的惡化而不斷加重。盡管CKD患者多伴隨高血壓、高脂血癥、糖尿病等并發(fā)癥，但這些傳統(tǒng)危險因子并不能完全解釋CKD患者高CVD發(fā)生率和病死率的現(xiàn)象。因此，CKD患者體內(nèi)可能存在其他的CVD致病因素。
　　尿毒癥毒素是一組因腎功能下降而潴留于CKD患者體內(nèi)的代謝終產(chǎn)物，對心血管系統(tǒng)的潛在毒性作用受到廣泛的關(guān)注。其中，小分子蛋白結(jié)合類毒素主要包括酚類、吲哚類、馬尿酸類、聚胺類、糖基化合物類、同型半胱氨酸等毒素，因其蛋白結(jié)合

3、特性而無法通過常規(guī)透析治療方法去除。多項臨床研究分析顯示，酚類毒素中的硫酸鹽對甲酚（p-cresyl sulfate，PCS）與CKD患者CVD病死率有強(qiáng)烈的相關(guān)性，但其具體的毒性效應(yīng)及致病機(jī)制尚未完全明確。本論文擬通過體內(nèi)、外實驗，研究PCS對心血管系統(tǒng)的潛在毒性效應(yīng)及機(jī)制，為臨床治療CKD及干預(yù)CVD發(fā)生和發(fā)展提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　第一部分：
　　1）通過5/6部分腎臟切除（Nx），結(jié)合PCS喂養(yǎng)，建

4、立PCS升高的動物模型；采用超聲心動圖和心臟切片染色的方法，評價Nx和PCS對于心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響；
　　2）體外培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)、蛋白印跡、Caspase-3活性檢測、免疫熒光等方法檢測PCS對H9c2細(xì)胞的毒性作用；應(yīng)用NADPH氧化酶/活性氧抑制劑（apocynin和NAC），進(jìn)一步探究潛在的機(jī)制；
　　3）建立PCS升高的動物模型，運用超聲心動圖來評價apocynin對于心臟功能的保護(hù)作用。第二部分

5、：
　　1）選擇5周齡 ApoE-/-小鼠，高膽固醇飲食，建立 PCS升高的動脈粥樣硬化動物模型；建模8周后，采用活體熒光顯微鏡和蛋白印跡技術(shù)，進(jìn)一步研究PCS對白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間粘附的影響；對主動脈大體和主動脈根部切片進(jìn)行油紅O染色，評價PCS對動脈粥樣硬化斑塊大小的影響；
　　2）建模24周后，對主動脈根部冰凍切片進(jìn)行組織學(xué)染色（油紅O、MOMA-2、α-SMA、天狼猩紅、MMP-2和MMP-9），評價PCS對于主動脈根

6、部斑塊組成成分及穩(wěn)定性的影響；
　　3）體外培養(yǎng)大鼠VSMCs，通過Transwell小室實驗檢測PCS對細(xì)胞遷徙能力的影響；利用蛋白印跡技術(shù)，半定量分析MMPs和TIMPs表達(dá)量的變化。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分：
　　1）在體動物實驗發(fā)現(xiàn)：對于5/6腎臟切除小鼠，PCS干預(yù)促進(jìn)心肌細(xì)胞的損傷和凋亡，并引起心臟功能的改變，具體表現(xiàn)為二尖瓣血流頻譜E峰速度（E）和A峰速度（A）比值的改變；NADPH氧化酶抑制

7、劑Apocynin能夠減輕PCS引起的E/A比值變化。
　　2）體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)：中、高濃度PCS能夠促進(jìn)H9c2細(xì)胞的凋亡，并且引起NADPH氧化酶p22phox和p47phox亞基的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成；Apocynin和NAC均能夠抑制PCS引起的不良效應(yīng)。
　　第二部分：
　　1）在體動物實驗發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過8周的喂養(yǎng)，PCS干預(yù)引起小鼠主動脈斑塊的生長；此外，PCS還促進(jìn)了粘附分子的表達(dá)，

8、并引起白細(xì)胞在內(nèi)皮表面滾動和粘附的增加；經(jīng)過24周的喂養(yǎng)，PCS干預(yù)引起斑塊內(nèi)組成成分的改變，引起斑塊穩(wěn)定的降低；
　　2）體外細(xì)胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)：PCS能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷徙，并引起MMPs和TIMPs的失衡。
　　研究結(jié)論：
　　1）PCS促進(jìn)慢性腎病時心肌細(xì)胞的損傷和心臟組織的重構(gòu)，并對心臟的舒張功能產(chǎn)生顯著影響；該作用可能與NADPH氧化酶的激活和細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加有關(guān)。
　　2）PCS促進(jìn)動脈粥樣硬