黃曲霉毒素M-,1-直接競爭ELISA與無毒體系的建立.pdf

1、黃曲霉毒素(簡稱AF)是真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要由黃曲霉、寄生曲霉和特曲霉產(chǎn)生，廣泛存在于花生、棉籽、玉米、小麥和稻米等農(nóng)產(chǎn)品中。因AF具有強(qiáng)烈的毒性和致癌性，1993年AF被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物。AF是一類結(jié)構(gòu)類似化合物，已經(jīng)分離鑒定出黃曲霉毒素B<,1>(簡稱AFB<,1>)、B<,2>、G<,1>、G<,2>、M<,1>、M<,2>等二十余種，其中以AFB<,1>毒性最強(qiáng)，AFM<,1>毒性雖然低于

2、AFB<,1>，然而與氰化鉀和砒霜相比，仍屬劇毒物質(zhì)，為強(qiáng)致癌劑。 為了防止AFM<,1>含量超標(biāo)的食品尤其是乳制品進(jìn)入人類食物鏈，許多國家已經(jīng)制定了食品中AFM<,1>的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立一種快速檢測AFM<,1>的方法具有重要意義。 本論文研究的內(nèi)容主要包括以下兩個(gè)方面： 1．黃曲霉毒素M<,1>直接競爭ELISA的建立 (1)制備AFM<,1>肟化物，然后通過活潑酯法將AFM<,1>肟與辣根過氧化

3、物酶進(jìn)行偶聯(lián)。 (2)通過棋盤滴定法確定抗AFM<,1>單抗與AFM<,1>-HRP的最佳工作濃度，然后以該濃度為基礎(chǔ)建立AFM<,1>直接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低檢測下限為0.1ng/mL，線性范圍是0.1 ng/ml至4 ng/ml，IC<,50>是2.2 ng/ml。 2．采用噬菌體隨機(jī)展示肽庫淘選AFM<,1>模擬表位 (1)以抗AFM<,1>單克隆抗體為靶分子，從噬菌體隨機(jī)7肽庫中進(jìn)行4輪親和淘選。

4、從第4輪噬菌平板上隨機(jī)挑選21個(gè)噬菌斑，經(jīng)間接ELISA和間接競爭ELISA鑒定，獲得了4個(gè)能與抗AFM<,1>單克隆抗體結(jié)合并且不和封閉液發(fā)生交叉反應(yīng)的陽性噬菌體克隆，這4號(hào)噬菌體均能被黃曲霉毒素M<,1>抑制，分別編號(hào)為A1，A2，A3，A4。 (2)提取上述4個(gè)噬菌體的DNA，進(jìn)行測序。根據(jù)噬菌體文庫簡要遺傳密碼將插入的DNA序列翻譯成氨基酸序列。A1，A2兩號(hào)噬菌體插入片段氨基酸．序列為LTSFPRH，A3，A4兩號(hào)噬菌