索科線蟲SAFLP親緣關(guān)系分析及長PCR技術(shù)在其線粒體全基因組測(cè)序中應(yīng)用.pdf

1、索科線蟲(Mermithidae)是一類寶貴的生防資源，某些屬級(jí)的分類目前還存在一些爭議，研究索科線蟲的遺傳背景，正確鑒定線蟲種類或品系，分析不同種類線蟲之間的親緣關(guān)系，對(duì)于線蟲的實(shí)際應(yīng)用具有十分重要的意義。 SAFLP已經(jīng)在分類、基因組分析、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系的鑒定、分子標(biāo)記的篩選和基因組DNA多態(tài)性分析等方面廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)首次將SAFLP技術(shù)應(yīng)用于昆蟲病原索科線蟲親緣關(guān)系研究，建立并優(yōu)化了索科線蟲SAFLP

2、體系，構(gòu)建了我國常見索科線蟲6屬10余種/亞種的指紋圖譜。采用EcoR I和MseI兩種限制性內(nèi)切酶單酶切，結(jié)果顯示EcoR I酶更適合作為索科線蟲SAFLP的內(nèi)切酶。3個(gè)帶有3個(gè)選擇性堿基的EcoR I引物進(jìn)行擴(kuò)增共得條帶225個(gè)，片段大小為250～1650bp。通過NTsys-PC2.1軟件計(jì)算了6屬11種/亞種索科線蟲的Nei-Li遺傳距離(0.1980～0.4554)和相似系數(shù)，利用NTsys-PC2.1軟件中的UPGMA方法構(gòu)

3、建這其聚類圖。6屬11種/亞種索科線蟲從屬級(jí)階元可以分為兩大類群：羅索屬(Romanomermis)和八腱索屬(Octomyomermis)聚為一支構(gòu)成第一大類群；六索屬(Hexamermis)與卵索屬(Ovomermis)先聚在一起然后與多索屬(Agamermis)聚在一起，再與兩索屬(Amphimermis)聚在一起構(gòu)成第二大類群。在八腱索屬和兩索屬中屬內(nèi)不同種/亞種間線蟲采集地相距較近的其遺傳距離較近。在八腱索屬中：Octomyo

4、mermis sp．A+(O. huazhongensis+Octomyomermis sp．C)，在兩索屬中：(Amphimermis sp．B+Amphimermis sp．A)+Amphimermis sp．C。優(yōu)化的索科線蟲SAFLP體系能夠反映索科線蟲種屬間的親緣關(guān)系，并與形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果基本相符，可以用于屬種的分類和親緣關(guān)系的研究。 線蟲線粒體全基因組對(duì)線粒體基因組的進(jìn)化，線蟲系統(tǒng)發(fā)育、種類鑒定、分子分類，以及線粒體

5、突變相關(guān)疾病和細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡等方面具有重要的研究意義。目前，國外僅對(duì)6種索科線蟲線蟲(Romanomermis culicivorax、R.．iyengan、R．nielseni、Thaumamermis cosgrovci、Agamermis sp．、Hexamermis agrotis)線粒體全基因組進(jìn)行了研究，國內(nèi)此領(lǐng)域還屬空白。 本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用長PCR技術(shù)展開了我國索科線蟲線粒體全基因組的初步研究。在前人研究基礎(chǔ)上，

6、設(shè)計(jì)出一套適合中華卵索線蟲(Ovomermis sinensis)線粒體基因組研究的實(shí)驗(yàn)方案。 通過已經(jīng)測(cè)序的線蟲線粒體基因序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，擴(kuò)增出中華卵索線蟲線粒體基因組中4.4 Kb的片段，測(cè)序后根據(jù)這一片段中所包含的細(xì)胞色素b基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增出剩下的中華卵索線蟲線粒體基因，約23 Kb。采用步移法對(duì)兩個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序。兩個(gè)片段間存在較大重復(fù)區(qū)域，根據(jù)重復(fù)區(qū)進(jìn)行拼接得到中華卵索線蟲線粒體全基因組。本研究從實(shí)驗(yàn)方法上初步