基于長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的貝類皰疹病毒全基因組高通量測(cè)序及變異分析.pdf

1、20世紀(jì)70年代美國(guó)首次出現(xiàn)皰疹病毒感染軟體動(dòng)物（一批養(yǎng)殖試驗(yàn)用美洲牡蠣）的案例，但并未對(duì)當(dāng)?shù)睾腿蚱渌貐^(qū)牡蠣和貝類養(yǎng)殖業(yè)造成損害。然而進(jìn)入90年代后，皰疹病毒感染引起的牡蠣、扇貝、蛤類和鮑等貝類的死亡案例在全球范圍內(nèi)（主要包括歐洲、美國(guó)、澳洲以及我國(guó)）頻繁發(fā)生，給當(dāng)?shù)刎愵愷B(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)形態(tài)學(xué)電鏡觀察、病毒分離純化和全基因組測(cè)序比對(duì)后，兩種新皰疹病毒：牡蠣皰疹病毒（Ostreid herpesvirus1，OsHV-1）和

2、鮑皰疹病毒（Haliotid herpesvirus1，HaHV-1）被相繼鑒定出來(lái)。OsHV-1和HaHV-1同隸屬于軟體動(dòng)物皰疹病毒科（Malacoherpesviridae），是該病毒科下唯一已知的兩個(gè)病毒種。OsHV-1屬于牡蠣皰疹病毒屬（Ostreavirus），可感染多種雙殼貝類；HaHV-1屬于鮑皰疹病毒屬（Aurivirus），感染單殼貝類。
　　隨時(shí)間的發(fā)展，OsHV-1也發(fā)生了較強(qiáng)的株系分化。但受制于技術(shù)所限，

3、對(duì)不同年代變異株基因組序列信息的掌握甚少。本研究嘗試?yán)没陂L(zhǎng)片段PCR方法的貝類皰疹病毒基因組富集技術(shù)，對(duì)低溫凍存的多年份櫛孔扇貝及魁蚶感染OsHV-1和九孔鮑感染HaHV-1的基因組進(jìn)行富集，使用高通量測(cè)序技術(shù)獲取OsHV-1不同變異株序列信息，并分析了不同變異株與其他變異株的基因組變異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究方法及部分結(jié)果如下：
　　第一部分：建立一套對(duì)于長(zhǎng)期低溫凍存貝類病料樣本中牡蠣皰疹病毒的基因組富集方法，通過(guò)病毒懸液法提取

4、病毒基因組DNA，根據(jù)參考基因組（207,439 bp）設(shè)計(jì)23對(duì)引物，使用Takara高保真聚合酶GXL擴(kuò)增了2001年份凍存的櫛孔扇貝牡蠣皰疹病毒全基因組，并使用Illumina Hiseq PE2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行第二代測(cè)序；同時(shí)使用PacBio RS II系統(tǒng)進(jìn)行第三代高通量測(cè)序（SMRT）。第二代測(cè)序共獲得8個(gè)Scaffolds，分別為170,095、18,675、1929、1805、1395、834、825和600 b

5、p。第三代測(cè)序獲得117,873個(gè)clean subreads，平均長(zhǎng)度7202 bp。組裝后對(duì)于基因組末端序列以及有問(wèn)題的區(qū)域通過(guò)Sanger測(cè)序以及二代測(cè)序作進(jìn)一步驗(yàn)證。修補(bǔ)后獲得長(zhǎng)204,783 bp的全基因組序列?；?1個(gè)OsHV-1變異株的32個(gè)ORF基礎(chǔ)上進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示，2001年份分離的OsHV-1變異株與2009年分離自我國(guó)櫛孔扇貝的AVNV親緣關(guān)系最近，而與2008年以后出現(xiàn)的OsHV-1μvar及其相關(guān)

6、變異株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。OsHV-1變異株間的親緣關(guān)系受到宿主及時(shí)空分布范圍的影響。研究表明，本試驗(yàn)建立的OsHV-1基因組富集方法易用且有效。
　　第二部分：利用新建立的從凍存貝類病料中擴(kuò)增牡蠣皰疹病毒基因組的富集方法，成功擴(kuò)增了多年份櫛孔扇貝病料（2002年、2003年、2004年、2008年）及2015年魁蚶病料中OsHV-1的基因組。構(gòu)建小片段文庫(kù)，通過(guò)Illumina Hiseq PE2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序并進(jìn)行變異序

7、列分析。多年份病毒株第二代測(cè)序分別獲得長(zhǎng)度為180,686 bp、182,857 bp、190,414 bp、173,253 bp和192,676 bp的基因組。測(cè)序序列GC含量分別為38.6％（ZK2002）、38.8%（ZK2003）、38.9%（ZK2004）、38.8%（ZK2008）、38.5%（KH2015）。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示多年份櫛孔扇貝OsHV-1變異株與AVNV親緣關(guān)系最近，而與2008年以后出現(xiàn)的OsHV-1μv

8、ar及其相關(guān)變異株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。2015年OsHV-1魁蚶株與2012年分離自我國(guó)魁蚶的Os HV-1-SB親緣關(guān)系最近。本研究建立的基因組富集方法可以適用于OsHV-1不同變異株基因組的富集，并進(jìn)行后續(xù)的變異序列分析。
　　第三部分：參照新建立的從凍存貝類病料中擴(kuò)增牡蠣皰疹病毒基因組的富集方法，建立起擴(kuò)增鮑皰疹病毒基因組富集方法。通過(guò)病毒懸液法提取病毒基因組DNA，根據(jù)參考基因組設(shè)計(jì)引物，使用Takara高保真聚合酶GXL擴(kuò)增