尼古丁誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞EMT并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、背景與目的：近年來，盡管肺癌的檢查和治療手段取得了巨大進(jìn)步，但其死亡率一直高居不下，肺癌仍然是人類目前死亡率最高的腫瘤之一，原因之一是治療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療的耐藥性不能很好的解決。腫瘤干細(xì)胞（CSCs）是腫瘤細(xì)胞群體中一小部分具有自我更新及多向分化能力，并且具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等特性的細(xì)胞。CSCs學(xué)說認(rèn)為肺癌干細(xì)胞（LCSC）參與肺癌的癌變、發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥、以及腫瘤的復(fù)發(fā)等各個過程。另有研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT

2、）同樣能夠增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且可以增加腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性，這也許是兩者關(guān)系密切的重要證據(jù)。尼古丁作為煙草中重要化學(xué)物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)包括肺癌在內(nèi)的多種人類癌細(xì)胞的EMT和促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移。尼古丁誘導(dǎo)侵襲和EMT的過程可能是肺癌發(fā)生耐藥和轉(zhuǎn)移的重要機制，可能對肺癌干細(xì)胞能夠產(chǎn)生同樣的作用。闡明EMT相關(guān)信號通路與LCSC相互作用機制，有望為吸煙肺癌患者的后續(xù)治療開辟新途徑。本研究目的主要是富集肺癌干細(xì)胞，檢測其干細(xì)胞特性，并探索尼古丁

3、誘導(dǎo)的EMT對肺癌干細(xì)胞的作用，為后續(xù)進(jìn)一步分子機制研究奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法：（1）以人肺腺癌A549細(xì)胞株為研究對象；（2）應(yīng)用劃痕實驗和 Transwell侵襲實驗研究不同濃度尼古丁對肺癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力的作用；（3）通過使用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁對肺癌細(xì)胞EMT相關(guān)表面標(biāo)志物mRNA和蛋白水平的影響；（4）通過免疫熒光技術(shù)檢測尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT，發(fā)生β-cateni

4、n蛋白表達(dá)核轉(zhuǎn)移；（5）使用無血清懸浮培養(yǎng)法富集肺癌細(xì)胞球細(xì)胞；（6）應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測側(cè)群細(xì)胞（SP）在細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞間的含量差異；（7）應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD133在細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞中表達(dá)差異；（8）應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株中ABCG2和CD133的 mRNA表達(dá)水平差異，Western blot方法檢測細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株中ABCG2蛋白表達(dá)差異；（9）流式細(xì)胞術(shù)檢測

5、細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株中的細(xì)胞周期差異；（10）應(yīng)用CCK8法測定順鉑對肺癌細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度（IC50），繪制濃度-抑制率回歸曲線；（11）應(yīng)用Transwell侵襲實驗比較細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株體外侵襲能力差異；（12）應(yīng)用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁對細(xì)胞球細(xì)胞 EMT相關(guān)表面標(biāo)志物 mRNA和蛋白水平的影響；（13）通過Transwell侵襲實驗研究尼古丁對細(xì)胞

6、球細(xì)胞侵襲能力的影響；
　　結(jié)果：（1）0.1、1、10μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞株24h、48h后進(jìn)入劃痕區(qū)域細(xì)胞數(shù)量較0μmol/L組顯著增多，劃痕區(qū)域面積明顯縮小，經(jīng)方差分析尼古丁處理組遷移能力顯著高于未處理組（P=0.000）。
　?。?）1μmol/L和0μmol/L尼古丁處理細(xì)胞后，Transwell侵襲實驗穿過基底膜的肺癌細(xì)胞數(shù)量為：106±2和67±2，尼古丁處理組細(xì)胞侵襲能力顯著增強（P=0.000）。

7、
　?。?）尼古丁處理肺癌細(xì)胞株48h后，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)上調(diào)。0.1、1、10μmol/L尼古丁處理的肺癌細(xì)胞后， E-cadherin mRNA表達(dá)（0.81±0.03，0.49±0.01，0.39±0.05）低于未處理組細(xì)胞（1.00±0.12），與未處理組E-cadherin mRNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異（P=0.000，0.000，0.000）；0.1、1、10μmo

8、l/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞后， Vimentin mRNA表達(dá)（1.64±0.07，2.03±0.06，2.35±0.10）明顯高于未處理組細(xì)胞（1.00±0.12），與未處理組Vimentin mRNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異（P=0.000，0.000，0.000）；0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后，E-cadherin蛋白表達(dá)（0.27±0.002，0.25±0.005，0.18±0.003）低于未處理組細(xì)胞

9、（0.30±0.003），與未處理組E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.000，0.000，0.000）；0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后，Vimentin蛋白表達(dá)（0.52±0.008，0.86±0.005，1.14±0.010）高于未處理組細(xì)胞（0.37±0.005），與未處理組 Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.022，0.000，0.000）；1μmol/L尼

10、古丁處理24，48，72h的肺癌細(xì)胞組E-cadherin蛋白表達(dá)（0.47±0.009，0.31±0.008，0.23±0.003）低于未處理組細(xì)胞（0.69±0.001），與未處理組E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.000，0.000，0.000）；1μmol/L尼古丁處理24，48，72h的肺癌細(xì)胞組Vimentin蛋白表達(dá)（0.09±0.003，0.32±0.003，0.40±0.003）高于未

11、處理組細(xì)胞（0.06±0.002），與未處理組 Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.002，0.000，0.000）；
　?。?）1μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞48h后，免疫熒光檢測顯示β-catenin蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移。
　　（5）無血清懸浮培養(yǎng)能夠形成細(xì)胞球細(xì)胞，且細(xì)胞球可穩(wěn)定傳代。
　　（6）細(xì)胞球細(xì)胞SP陽性比例（12.36±1.47％）顯著高于親代肺癌細(xì)胞（5.79±0.11%），

12、兩組間SP表達(dá)比較具有顯著性差異（P=0.000）。
　?。?）細(xì)胞球細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133表達(dá)（15.90±0.32%）顯著高于親代肺癌細(xì)胞（0.40±0.02%），兩組間CD133表達(dá)比較具有顯著性差異（P=0.000）。
　?。?）細(xì)胞球細(xì)胞CD133 mRNA表達(dá)（1.45±0.02）顯著高于親代細(xì)胞（1.00±0.07），兩組間CD133 mRNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異（P=0.001）。

13、>　　（9）細(xì)胞球細(xì)胞 ABCG2 mRNA表達(dá)（1.48±0.05）顯著高于親代細(xì)胞（1.00±0.05），兩組間 ABCG2 mRNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異（P=0.000）；細(xì)胞球細(xì)胞 ABCG2蛋白表達(dá)（0.75±0.001）顯著高于親代細(xì)胞（0.20±0.004），兩組間 ABCG2蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.000）。
　?。?0）細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布經(jīng) F檢驗

14、有顯著性差異（P=0.000）。細(xì)胞周期兩兩比較：細(xì)胞球細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞含量（79.55±1.63%）顯著高于親代肺癌細(xì)胞（53.15±2.19%），兩組間比較具有顯著性差異（P=0.005）；細(xì)胞球細(xì)胞 G2/M期細(xì)胞含量（18.85±1.48%）與親代細(xì)胞（19.75±4.03%），兩組比較無明顯差異（P=0.795）；細(xì)胞球細(xì)胞S期細(xì)胞含量（1.62±0.06%）顯著低于親代細(xì)胞（27.15±1.91%），兩組間比較具有顯著性

15、差異（P=0.003）。
　?。?1）細(xì)胞球細(xì)胞對DDP的IC50值（7.07±0.85μg/L）顯著高于親代細(xì)胞（2.25±0.35μg/L），兩組細(xì)胞對DDP48h的IC50值比較有顯著性差異（P=0.000）。
　　（12）細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株Transwell侵襲實驗穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量分別為：85±4和67±2，細(xì)胞球組穿過基底膜細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P=0.001）。
　?。?3）肺癌細(xì)胞球細(xì)胞經(jīng)尼古丁處

16、理后EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)上調(diào)。1μmol/L尼古丁處理48h的肺癌細(xì)胞組E-cadherin mRNA表達(dá)（0.60±0.02）低于未處理組細(xì)胞（1.00±0.12），兩組間E-cadherin mRNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異（P=0.000）；1μmol/L尼古丁處理處理48h的肺癌細(xì)胞組Vimentin mRNA表達(dá)（1.21±0.03）高于未處理組細(xì)胞（1.00±0.

17、03），兩組間Vimentin mRNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異（P=0.001）；0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后，E-cadherin蛋白表達(dá)（0.55±0.030，0.40±0.011，0.22±0.014）低于未處理組細(xì)胞（0.79±0.008），與未處理組E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.000，0.000，0.000）；0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后，Vim

18、entin蛋白表達(dá)（0.18±0.009，0.43±0.011，0.54±0.002）高于未處理組細(xì)胞（0.15±0.002），與未處理組 Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.022，0.000，0.000）；1μmol/L尼古丁處理24，48，72h的肺癌細(xì)胞組E-cadherin蛋白表達(dá)（0.39±0.005，0.34±0.004，0.26±0.005）低于未處理組細(xì)胞（0.53±0.008），與未處理組

19、E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.000，0.000，0.000）；1μmol/L尼古丁處理24，48，72h的肺癌細(xì)胞組 Vimentin蛋白表達(dá)（0.17±0.002，0.22±0.003，0.25±0.002）高于未處理組細(xì)胞（0.13±0.006），與未處理組 Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異（P=0.004，0.000，0.000）；
　?。?4）1μmol/L和0

20、μmol/L尼古丁處理細(xì)胞球細(xì)胞后，Transwell侵襲實驗穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量為：140±8和85±4，1μmol/L細(xì)胞球組數(shù)量顯著增多（P=0.000）。
　　結(jié)論：（1）尼古丁處理肺癌細(xì)胞后從表面標(biāo)志物表達(dá)水平和生物學(xué)行為上均表現(xiàn)出明顯EMT現(xiàn)象，侵襲能力呈現(xiàn)劑量和時間依賴性顯著增強；（2）通過無血清懸浮培養(yǎng)得到肺癌細(xì)胞球細(xì)胞具有顯著增強的自我更新、增殖、分化、耐藥及體外侵襲遷移能力，細(xì)胞球細(xì)胞多處于細(xì)胞周期靜止期，高表