金黃色葡萄球菌膜蛋白nEbpS原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建及抗體的制備.pdf

1、金黃色葡萄球菌(金葡菌)是臨床常見致病菌之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，該菌主要是通過自身的彈性纖維結(jié)合蛋白(Elastin binding proteins of S．a(chǎn)ureus，EbpS)侵染宿主。EbpS是兩次跨膜蛋白，全基因長為1458bp，編碼486AA，分子量為117kDa。并且N端的59個氨基酸(amino acid，AA)是金葡菌和宿主彈性蛋白結(jié)合的主要位點. 本課題在獲得金黃色葡萄球菌全基因組的基礎上，首先根據(jù)Genba

2、nk中ATCC25923標準菌株基因組序列及EbpS蛋白的基因序列，設計出針對EbpS蛋白N端(Nterminal of Elastin Binding Proteins of S．a(chǎn)ureus，nEbpS)的引物，利用PCR方法采用高保真酶從提取的標準菌株基因組中擴增出nebps基因片段，片段長度為684bp，末端加A，雙酶切后將目的片段基因按照正確的讀碼框克隆到T克隆載體pMD19-T中，得到含nebps基因片段的pMD19-T(+

3、)重組子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，并對經(jīng)氨芐青霉素初步篩選的陽性重組子進行雙酶切鑒定和測序鑒定。將雙酶切鑒定正確并且測序結(jié)果與Genbank上nEbpS基因序列完全一致的陽性重組質(zhì)粒雙酶切處理，再與同樣經(jīng)雙酶切處理的表達載體pQE30連接，得到重組表達載體pQE30(+)/nebps，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌M15；37℃，1mM IPTG,200rpm誘導重組蛋白表達。經(jīng)SDS PAGE和Western blotting檢測后表明分

4、子量約53kDa的融合蛋白表達，與預期分子量大小(53.33kDa)一致，并且表達蛋白大部分以可溶形式存在。 利用目的蛋白的多聚組氨酸標簽進行鑷柱親和層析純化融合蛋白，經(jīng)Westemblotting鑒定，融合蛋白與His單抗能夠結(jié)合。純化出的蛋白經(jīng)PBS透析后超濾管濃縮，進行SDS-PAGE電泳檢測純度后，考馬斯亮藍染色法蛋白定量，采用100mg/ml的濃度與弗氏佐劑乳化制備抗原，免疫新西蘭兔子，收獲抗血清，通過與金葡菌菌體的凝