金黃色葡萄球菌fnbA基因的克隆、表達載體的構建及原核表達.pdf

1、為了探討將纖連蛋白結合蛋白A(FnBP—A)用于金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的基因治療和作為抗金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的藥物和診斷試劑進行開發(fā)，在克隆出纖連蛋白結合蛋白A基因(fnbA)的基礎上，構建了真核表達載體pEBF和原核表達載體pET-fnbA1并對fnbA基因進行了原核表達和表達產物功能進行了研究，為進一步純化和研究其在免疫治療金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎中的作用、研究新型DNA疫苗及生產轉基因動物奠定了基礎，同時也

2、為臨床上奶牛乳房炎的防治提供新方法和新手段。研究結果如下： 1.根據GenBank(登陸號：J04151)中公布的金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白A基因(fnbA)序列設計特異性引物，以金黃葡萄球菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得3.6kb的DNA片段，其中包含完整的編碼序列。序列分析表明，片段與GenBank中登錄的金黃葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白A序列的同源性為99.1％。在讀碼框內，只有六個堿基發(fā)生點突變。分析表明，這六

3、處突變不影響蛋白質功能。 2.利用定向克隆的方法，將純化的基因fnbA先克隆至pBCP中，然后定向克隆至真核表達載體pEGFP-C1中，最終構建了fnbA的乳腺特異性表達載體pEBF。載體含有抗性基因和綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因，并且報告基因和目的基因表達為非融合型表達。 3.利用定向克隆的方法，將fnbA克隆至pGEM—TeasyVector中，成功構建出了克隆質粒pGEM-fnbA1中。將純化的基因fnbA1亞

4、克隆至pET28a(+)中，構建出原核表達質粒pET-fnbA1。 4.將原核表達質粒pET-fnbA1，轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經IPTG誘導后SDS-PAGE分析，在約165ku處出現了與預期目的蛋白相一致的外源蛋白帶。 5.Westernblot分析重組蛋白，在目的蛋白相應位置出現了特異性的染色條帶，這表明所表達的重組蛋白能夠與金黃色葡萄球菌FnBP-A蛋白發(fā)生特異性結合，表明該蛋白是金黃