牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體凋亡發(fā)生和調(diào)控與其發(fā)育潛能關(guān)系研究.pdf

1、卵泡閉鎖的生理實(shí)質(zhì)就是激活顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的凋亡。相關(guān)研究認(rèn)為，體外條件下獲得的不同發(fā)育潛能的未成熟卵母細(xì)胞可能來(lái)源于處于不同閉鎖程度的卵泡，而發(fā)生閉鎖卵泡中的卵母細(xì)胞在體內(nèi)條件下是注定要走向凋亡的。所以，探討卵泡內(nèi)細(xì)胞凋亡與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的相關(guān)性，已成為相關(guān)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究通過(guò)建立不同發(fā)育潛力卵母細(xì)胞的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，采用多種凋亡檢測(cè)手段，檢測(cè)牛卵丘.卵母細(xì)胞復(fù)合體中卵-丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞凋亡情況及其與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的相關(guān)性,同時(shí)

2、在體外成熟系統(tǒng)中添加外源FasL以誘發(fā)卵母細(xì)胞凋亡，探討Fas信號(hào)通路對(duì)卵母細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，了解牛卵母細(xì)胞凋亡與其發(fā)育潛能之間的相關(guān)性。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴根據(jù)卵胞質(zhì)均勻程度和卵丘細(xì)胞狀態(tài)，將卵丘細(xì)胞完整包被的COCs分為：I組(具有5層以上卵丘細(xì)胞且卵胞質(zhì)顆粒化)；II組(具有5層以上卵丘細(xì)胞且卵胞質(zhì)均勻)；Ⅲ組(具有2-5層卵丘細(xì)胞且卵胞質(zhì)顆?；?；IV組(具有2-5層卵丘細(xì)胞且卵胞質(zhì)均勻)。在此基礎(chǔ)上，利用地衣

3、紅染色與體外受精技術(shù)，檢查四類COCs中卵母細(xì)胞在體外成熟22小時(shí)后的核成熟情況與受精后的發(fā)育能力差異，以建立不同發(fā)育能力未成熟COCs形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，四組卵母細(xì)胞核成熟率為：71.8%、57.8%、84.2%、69.2%；卵裂率、囊胚發(fā)育率和孵化囊胚率分別為66.4%、22.7%和5.9%；57.5%、15.7%和3.9%；85.0%、38.9%和15.9%；75.0%、26.4%和8.6%。結(jié)果表明，I組和Ⅲ組卵母細(xì)胞核成熟率、

4、卵裂率、囊胚發(fā)育率和孵化囊胚率均分別高于II組和IV組。其中，Ⅲ組卵母細(xì)胞的上述各項(xiàng)指標(biāo)明顯高于II組(P<0.05)。由于顆?；寻|(zhì)與輕度擴(kuò)散卵丘細(xì)胞等形態(tài)特征被認(rèn)為是早期閉鎖發(fā)生的一種信號(hào)，所以本研究所建立的不同形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)COCs的發(fā)育能力差異可能與其卵泡所處不同早期閉鎖狀態(tài)相關(guān)。
　　 ⑵Annexin-V染色結(jié)果顯示，各組卵丘細(xì)胞中早期凋亡細(xì)胞占大多數(shù)(65.85%-83.20%)。Ⅲ組卵丘細(xì)胞中早期凋亡細(xì)胞比率顯著高于

5、其他三組(P<0.05)。I組早期凋亡細(xì)胞比率也明顯高于II組(P<0.05)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，各組卵丘細(xì)胞中晚期凋亡細(xì)胞比率較低(0.78%-6.35%)。其中，Ⅲ組卵丘細(xì)胞中晚期凋亡細(xì)胞比率顯著高于其他三組(P<0.05)。I組中晚期凋亡細(xì)胞比率也略高于II組(P>0.05)。結(jié)果表明，卵母細(xì)胞發(fā)育能力較高的I組與Ⅲ組中卵丘細(xì)胞也表現(xiàn)較高的凋亡水平，進(jìn)一步驗(yàn)證I組與Ⅲ組COCs可能采自具有較強(qiáng)早期閉鎖信號(hào)的卵泡。
　　

6、 ⑶免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，Bax蛋白主要定位于胞漿與細(xì)胞核附近；Bcl-2蛋白主要定位于細(xì)胞核及其附近區(qū)域。
　　 ⑷四組卵母細(xì)胞的Annexin-V陽(yáng)性率分別為28.6%、14.7%、46.4%和26.1%。其中，Ⅲ組卵母細(xì)胞Annexin-V陽(yáng)性率顯著高于其他三組(P<0.05)；II組Annexin-V陽(yáng)性率最低；實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Ⅲ組卵母細(xì)胞中Bax相對(duì)表達(dá)量顯著高于II組(P<0.05)。I組和Ⅲ組中

7、Bax的相對(duì)表達(dá)量要分別高于II組和IV組。結(jié)果表明未成熟卵母細(xì)胞中早期凋亡程度與其發(fā)育能力呈正相關(guān)。
　　 ⑸免疫熒光染色結(jié)果顯示，F(xiàn)as蛋白在未成熟卵母細(xì)胞中有表達(dá)，而未檢測(cè)到FasL蛋白。Fas蛋白主要定位于卵母細(xì)胞膜上、核附近以及胞漿中個(gè)別區(qū)域。
　　 ⑹成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的FasL，觀察其對(duì)成熟后卵母細(xì)胞早期和晚期凋亡的影響。Annexin-V染色結(jié)果顯示，2、10、50ng組中Annexin-V陽(yáng)性卵母

8、細(xì)胞率(55.3%，51.2%，62.4%)顯著高于對(duì)照(Ong)組(13.6%)(P<0.05)。TUNEL結(jié)果顯示，對(duì)照(Ong)組中未發(fā)現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性卵母細(xì)胞；2、10、50ng處理組中觀察到不同比例的陽(yáng)性細(xì)胞(20.8%，41.6%，48.4%)。其中，各處理組晚期凋亡陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組；10ng、50ng組顯著高于2ng處理組(P<0.05)。數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)asL促進(jìn)了成熟后卵母細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且凋亡誘導(dǎo)因子的濃度與凋亡細(xì)胞

9、率呈正相關(guān)。
　　 ⑺核成熟結(jié)果顯示，添加2ng組中卵母細(xì)胞達(dá)MII期比率(67.9%)明顯高于Ong組(45.6%)(P<0.05)。極體排出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2ng組極體率(83.0%)顯著高于對(duì)照組(63.2%)；10ng與50ng組極體率(53.7%和50.0%)低于對(duì)照組。囊胚率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2ng組(22.0%)和對(duì)照(Ong)組(21.8%)囊胚率沒(méi)有差異，10ng(11.5%)與50ng(6.4%)組囊胚率顯著低于