胃癌血清蛋白標記物的篩選與鑒定.pdf

1、背景：
　　胃癌一直以來都是嚴重威脅全世界人類健康的惡性腫瘤之一，也是我國最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率常年居高不下。胃癌的預后較差，尤其以腫瘤發(fā)展至進展期為甚，且及早的診斷和治療可明顯的改善胃癌患者的預后，降低其死亡率。但多數胃癌早期患者沒有明顯的自覺癥狀，或僅僅表現為惡心、嘔吐等無特異性的胃腸道癥狀，容易與胃炎、胃潰瘍等相混淆，無法引起人們的重視，從而延誤了病情，錯失最佳的治療時機。往往就診時多數患者已經處于局部晚期

2、或發(fā)生了遠處轉移，所以早期的診斷與治療是改善胃癌患者預后的關鍵。目前，臨床上診斷胃癌常用的影像學檢查主要包括胃鏡及上消化道造影等，但由于醫(yī)生的診斷水平不盡相同，胃癌早期患者的檢出率并不高，而且胃鏡檢查是一種有創(chuàng)的檢查，會引起患者不適，其費用較高，因而在胃癌高危人群中不易普及。同時CEA、CA19-9、CA72-4等作為臨床上常用的血清腫瘤標記物，因缺乏敏感性及特異性對于胃癌患者的早期診斷幫助并不大。在這樣的背景下，臨床上迫切需要找到新的

3、與胃癌相關的具有高度敏感性和高度特異性的分子標記物，這也成為了胃癌相關研究的熱點。
　　蛋白質組學自提出后就得到了飛速的發(fā)展，其含義包括蛋白質和基因組兩方面內容，可以理解為一種基因組轉錄表達的全套蛋白質。蛋白質組學的研究象征著生物學進入了后基因時代，其本質是以蛋白質組為研究對象，從整體的角度去分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成及其活動的規(guī)律，在建立正常蛋白質表達指紋圖譜的基礎上，通過對正常人和患者（血清或瘤體）的蛋白質組進行比較分析，

4、從而找到與某種疾病有關的特異性蛋白質。這些具有特異性的蛋白質不僅可以作為某種疾病早期診斷的蛋白標記物，而且也可為藥物的研發(fā)提供新的分子靶點。進而對這些蛋白標記物的結構和功能進行研究，為疾病的發(fā)生發(fā)展提供病理生理學機制。蛋白質組學被認為是篩選特異性蛋白質標記物和藥物分子靶點最有效的方法之一，隨著相關技術不斷的更新?lián)Q代，為我們篩選和鑒定胃癌患者血清特異性標記物提供了技術平臺，開辟了胃癌研究的新領域。
　　本次實驗主要依托表面增強激光解

5、吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術對胃癌患者血清（術前組、術后組、轉移組）與正常對照組血清之間進行對比檢測，篩選出胃癌患者血清中存在的特異性蛋白質或含量與正常人血清有差異的蛋白質。使用凝膠電泳（TRICINE-SDS-PAGE）技術對這些差異性蛋白質進行分離與純化。通過基質輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF）技術對分離純化的蛋白質進行鑒定，最終確定胃癌患者血清中具有特異性的蛋白標記物。后期研究其

6、結構與功能，探索特異性蛋白質的表達與胃癌發(fā)生發(fā)展的關系，為胃癌的早期診斷及下一步的臨床治療提供了可能和依據。
　　目的：
　　通過蛋白組學技術篩選并鑒定胃癌患者血清中可能存在的特異性蛋白標記物，為胃癌的早期診斷提供更為完善的血清蛋白質指紋圖譜模型，為進一步研究胃癌的血清特異性蛋白標記物打下堅實的基礎。
　　材料與方法：
　　材料：本研究材料收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院普通外科自2013年5月至2014年1月前來就診的

7、60例首診胃癌患者，其中男性患者46例，女性患者14例，年齡42~84歲，平均年齡58±0.5歲。其中20例就診時已證實胃癌多發(fā)轉移，未經手術治療，采集血清標本設為轉移組。余40例患者原發(fā)胃癌診斷明確，且無手術禁忌擬行手術治療，于術前1天和術后第12天各采集血清標本一次，分別設為術前組和術后組。所有患者采集標本前均未接受化療、放療等治療，經手術和病理診斷為胃腺癌，其組織病理分型均為中、低分化型腺癌。病理學診斷均經過兩位以上的病理學專家的

8、證實。所有60例患者的血樣標本均自清晨空腹狀態(tài)下抽取，血液抽取后將血樣放置于干燥試管中于室溫下靜置1小時使血液自然凝固，而后在離心機中以3000 r/min的速度進行離心15min，抽取離心沉淀后的上清液移至 PE管中，置入-80℃冰箱進行保存。本實驗通過了本院倫理委員會的倫理審查，受試者均已簽署知情同意書。
　　方法：冰浴中解凍血清，4℃10000r/min離心2min。取96孔板置于冰盒上，每孔加入U9(9mol/L尿素)，1

9、％ Bar，2%CHAPS10μL，血清和瘤體組織總蛋白樣本5μL，4℃層析柜中600r/min振蕩30min。在震蕩結束前15 min做蛋白質芯片預處理，芯片裝入加樣器 Bioprocessor中，標記下芯片號碼，每孔加入NaAC(100mmol/L，pH4)200μL，層析柜中600r/min振蕩2min，重復以上操作1次。經過U9處理后的96孔板置于冰盒上，用排槍加入NaAC185μL，層析柜中4℃600r/min震蕩2min。取

10、已處理的樣本100μL加到蛋白質芯片上，置于層析柜中4℃600r/min結合60min，甩去殘液，快速拍干。然后加入NaAC200μL，600r/min振蕩5min后，甩去殘液，快速拍干，重復3次。用200μL去離子水沖洗各孔2次，甩干。芯片風干后，每孔分兩次加入50%飽和的SPA1μL，干燥后上機待檢測。用已知分子量的蛋白質芯片對SELDI-TOF-MS系統(tǒng)進行校正，使蛋白質分子量誤差小于0.1%，然后將結合好蛋白質的WCX2蛋白質芯

11、片用質譜分析儀進行分析。質譜分析的原始數據經過濾噪音和聚類分析處理后，對初步篩選出的質荷比峰值數據做Wilconxon秩和檢驗，檢驗標準取小于0.01。通過P值來判斷同一m/z峰在各組之間表達的差異程度，P值越小提示這一m/z峰在兩組之間越有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.胃癌術前組與正常組的比較結果
　　胃癌術前組與正常組的質譜數據經過減掉基線、去噪及標準化處理，聚類分析得到各自的峰值，兩組峰值經過Wilcoxon

12、秩和檢驗，從而得到15個特異性m／z峰值(P<0．01)。其中在胃癌術前組低表達的為8個，高表達的7個。通過SVM篩選出youden指數最高的組合模型，得到m/z峰位于6449.1的蛋白標記物。在胃癌術前組呈高表達，表達強度為2299.3±2029.3。在正?；颊呓M明顯低表達，表達強度為509.5±168.3。兩組比較差值具有統(tǒng)計學意義(P<0．01)。
　　2.胃癌術后組與術前組的比較結果
　　胃癌術后組與術前組的質譜數據

13、經過處理和統(tǒng)計學分析后，得到 P<0．01的特異性m/z峰6個，其中術后組中高表達為4個，低表達為2個。參考youden指數最高的組合模型，得到m/z峰位于6449.2的蛋白質標記物。在胃癌術前組呈高表達，表達強度為1247.9±685.0。在正?；颊呓M明顯低表達，表達強度為476.5±157.8。兩組比較差值具有統(tǒng)計學意義(P<0．01)。
　　3.胃癌術前組與轉移組的比較結果
　　胃癌術前組與轉移組的質譜數據經過處理和統(tǒng)

14、計學分析后，得到 P<0．01的特異性m/z峰12個，其中轉移組組中高表達為1個，低表達11個。參考youden指數最高的組合模型，得到蛋白質標記物 m/z峰位于6448.9。在胃癌轉移組的表達強度明顯高于術前組，在胃癌轉移組表達強度為1506.9±1036.5。在胃癌術前組表達強度為649.7±621.0。兩組比較差值具有統(tǒng)計學意義(P<0．01)。
　　4.特異性蛋白的鑒定
　　通過 MALDI-TOF/TOF平臺對樣本

15、分離純化及酶解后所得到的肽段混合物進行檢測。m/z峰位于6449的蛋白質經過鑒定為Apo CⅢ（載脂蛋白CⅢ）。
　　結論：
　　1. m/z峰位于6449的蛋白質經過鑒定為Apo CⅢ，考慮為胃癌的血清特異性蛋白標記物，為胃癌的早期診斷提供更為完善的血清蛋白質指紋圖譜模型，對進一步研究胃癌的血清特異性蛋白標記物具有指導意義。
　　2. m/z峰位于6449的蛋白質在胃癌中的表達程度與其腫瘤進展程度呈正相關，為后期研究