LINC00161通過調(diào)控miR-645-IFIT2軸抑制骨肉瘤藥物抗性的分子機制研究.pdf

1、化療在骨肉瘤治療中發(fā)揮了重要作用，但是該方法總體有效率為60%左右。目前骨肉瘤新輔助化療的藥物為順鉑（CDDP），阿霉素（ADM），甲氨蝶呤（MTX）和異環(huán)磷酰胺（IFO）。順鉑是目前廣泛應(yīng)用抗腫瘤藥物之一。伴隨著治療過程的延長，骨肉瘤細(xì)胞會產(chǎn)生藥物抗性，導(dǎo)致治療的失敗。順鉑耐藥已經(jīng)成為骨肉瘤治療過程中的一個非常棘手的問題。耐藥產(chǎn)生的機制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。
　　骨肉瘤對化療藥物的抗性是其治療難點。最近，越來越多證據(jù)表明長

2、非編碼RNA(lncRNAs)在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。但參與調(diào)控骨肉瘤化療藥物抗性的lncRNAs尚未見報道。因此，我們對lncRNAs是否調(diào)控順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡，如何影響藥物抗性進行研究。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在順鉑藥物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的過程中，LINC00161被激活且表達(dá)上調(diào)，并證明高表達(dá)的LINC00161可以促進順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。在藥物抗性產(chǎn)生過程中，由于LINC00161的表達(dá)被抑制導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物抗性而

3、凋亡減少。對LINC00161如何調(diào)控骨肉瘤凋亡及藥物抗性的機制進一步研究結(jié)果表明：LINC00161可以吸附內(nèi)源的miR-645并且抑制其活性，進而增加骨肉瘤細(xì)胞中IFIT2表達(dá)，IFIT2蛋白可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。證明其機制為LINC00161通過調(diào)控miR-645-IFIT2信號通路促進順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，降低順鉑抗性。因此，這些研究結(jié)果表明LINC00161是順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡的重要調(diào)控因素，LINC00161-miR-645

4、-IFIT2軸在降低骨肉瘤藥物抗性中發(fā)揮重要作用。通過本研究，LINC00161可作為骨肉瘤耐藥的一種生物標(biāo)志物，而且還可以作為骨肉瘤治療的靶點，這些有助于對順鉑治療骨肉瘤及減小藥物抗性提供新思路。
　　實驗一 LINC00161調(diào)控順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡
　　目的：
　　研究LINC00161在順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡中的作用
　　方法：
　　通過RNA芯片技術(shù)篩選順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡的目標(biāo)LncRNAs。驗證

5、芯片檢測結(jié)果，利用q-RT-PCR與Western Blot分析檢測順鉑處理不同時間（0、6h、12h、24h）及不同劑量（0μΜ,5μΜ，10μΜ）骨肉瘤細(xì)胞內(nèi) LINC00161的mRNA表達(dá)水平差異，凋亡標(biāo)記物的表達(dá)差異。同樣方法檢測MG-63細(xì)胞系內(nèi)LINC00161的表達(dá)情況。為了進一步明確LINC00161在順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用，在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)通過轉(zhuǎn)染敲低LINC00161表達(dá)，另一方面使LINC00161過表達(dá)，q

6、-RT-PCR和Western Bolt檢測順鉑處理24h后凋亡變化。
　　結(jié)果：
　　Western Blot結(jié)果顯示隨著順鉑處理劑量（0μΜ,5μΜ，10μΜ）與時間（0、6h、12h、24h）的增加，骨肉瘤細(xì)胞凋亡標(biāo)記物PARP及Cleaved-PARP表達(dá)增加。q-RT-PCR檢測結(jié)果顯示隨著順鉑處理不同時間（0、6h、12h、24h）以及不同劑量（0μΜ,5μΜ，10μΜ）的增加，骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)LINC00161的m

7、RNA水平表達(dá)上調(diào)。敲低和過表達(dá)LINC00161后，Q-RT-PCR和Western Bolt、Annexin V和 PI雙染流式檢測結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞中LINC00161敲低后凋亡減少，LINC00161過表達(dá)后凋亡增加。
　　結(jié)論：
　　1.在順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡的過程中，LINC00161的表達(dá)和凋亡存在正相關(guān)。
　　2． LINC00161對順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡有促進作用。
　　實驗二 LINC00161通

8、過調(diào)控IFIT2抑制骨肉瘤細(xì)胞藥物抗性
　　目的：
　　研究 LINC00161通過靶蛋白 IFIT2參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞藥物抗性及細(xì)胞凋亡。
　　方法：
　　構(gòu)建順鉑耐藥細(xì)胞株（U2OSR），利用U2OSR為對照，通過轉(zhuǎn)染使U2OSR中LINC00161表達(dá)上調(diào)，q-RT-PCR和Western Blot檢測骨肉瘤細(xì)胞LINC00161表達(dá)差異與凋亡相關(guān)標(biāo)志物PARP及casepase-3差異。進行Annexin

9、 V和 PI雙染流式、細(xì)胞克隆形成實驗檢測兩組細(xì)胞凋亡差異。
　　iTRAQ檢測與 LINC00161作用相關(guān)性最強的靶蛋白-IFIT2，Western Blot分別從順鉑處理不同時間和不同劑量兩方面進行驗證。證明 IFIT2蛋白是受LINC00161調(diào)控，分別對骨肉瘤細(xì)胞內(nèi) LINC00161敲低和過表達(dá)，RT-PCR檢測IFIT2 mRNA變化，Western Blot檢測IFIT2蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　

10、耐藥株U2SR對順鉑處理產(chǎn)生藥物抗性。耐藥株（U2OSR）中轉(zhuǎn)染外源性LINC00161后，可以使LINC00161表達(dá)上調(diào)，再次用順鉑處理后，耐藥株順鉑的藥物抗性降低，凋亡增加。
　　RT-PCR顯示 IFIT2的mRNA未變化。Western Blot顯示隨著順鉑藥物處理U2OS時間與劑量的增加，IFIT2蛋白的表達(dá)也隨之升高并且發(fā)現(xiàn)，順鉑藥物處理后的骨肉瘤細(xì)胞系（U2OS、MG63）中IFIT2蛋白表達(dá)的升高與 LINC00

11、161表達(dá)水平密切相關(guān)。LINC00161通過上調(diào) U2OS/U2OSR中 IFIT2的表達(dá)促進并調(diào)控藥物介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡；并且，抑制 U2OS/U2OSR內(nèi)源性 IFIT2的表達(dá)直接阻斷了順鉑對 U2OS/U2OSR凋亡的誘導(dǎo)。
　　結(jié)論：
　　1.骨肉瘤細(xì)胞系耐藥株中 LINC00161的低表達(dá)使骨肉瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性即藥物抗性。
　　2. LINC00161調(diào)控了 IFIT2蛋白的表達(dá)，且 LINC0016

12、1、 IFIT2的表達(dá)水平與順鉑介導(dǎo)的U2OS/U2OSR凋亡密切相關(guān)。
　　3 LINC00161作用機制不影響IFIT2的mRNA水平變化。
　　實驗三 LINC00161通過 miR-645-IFIT2軸影響骨肉瘤細(xì)胞的藥物抗性并調(diào)控藥物介導(dǎo)的凋亡
　　目的：
　　研究LINC00161通過調(diào)控IFIT2蛋白表達(dá)影響骨肉瘤凋亡及藥物抗性的機制
　　方法：
　　用Ago2（Argonaute蛋白）

13、抗體形成免疫沉淀蛋白，RT-PCR檢測Ago2沉淀中 LINC00161表達(dá)變化。熒光素酶報告基因分析及驗證LINC00161和miR-645表達(dá)相關(guān)性，檢測LINC00161是否通過競爭性結(jié)合miR-645促進IFIT2的表達(dá)。在U2OS及U2OSR中通過Western Blot對 LINC00161、 miR-645及 IFIT2的表達(dá)相關(guān)性進行蛋白水平的檢測，分析LINC00161調(diào)控順鉑誘導(dǎo)U2OS的凋亡及藥物抗性的機制。

14、>　　結(jié)果：
　　LINC00161具有類似ceRNA角色的功能，出現(xiàn)在Ago2復(fù)合物中，可以通過競爭性地結(jié)合miR-645。熒光素酶報告基因分析及驗證實驗證明miR-645可以結(jié)合在LINC00161上，Western Blot結(jié)果說明下調(diào)miR-645表達(dá)可以增強U2OS的凋亡，上調(diào)則抑制凋亡。過表達(dá)的IFIT2可以被過表達(dá)的miR-645抵消。過表達(dá)的LINC00161促進細(xì)胞凋亡的機制是通過抑制miR-645調(diào)控的。LIN