單壁碳納米管暴露致肺免疫毒性介導凝血纖溶系統(tǒng)改變的間接毒性作用研究.pdf

1、納米材料具有特殊的物理、化學性質，因而被廣泛應用于醫(yī)藥、電子、化工、環(huán)保等諸多領域。進入環(huán)境的納米材料正在成為一類新型污染物，對人類的健康構成現(xiàn)實威脅。目前，很多國家就納米材料安全性問題，展開了多種項目和計劃，其目的是控制納米技術的風險性。開展納米材料生物安全性的基礎研究，建立納米材料生物安全性評價的關鍵技術，是促進納米材料合理利用的必然要求，具有重大科學意義和社會效益。納米材料進入人體的主要途徑之一是呼吸道的暴露。大量流行病學及實驗研

2、究證明，吸入污染空氣中的顆粒物可導致心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加。其中，納米顆粒物即超細顆粒物，可能在大氣顆粒物誘發(fā)心血管疾病方面起主要作用。到目前為止，依然缺乏有關納米顆粒物經(jīng)呼吸道吸入后誘發(fā)心血管毒性效應的系統(tǒng)性研究資料，其背后可能的作用機制仍未完全闡明。作為一種典型的納米材料，單壁碳納米管(single-walled carbon nanotube，SWCNT)已經(jīng)成為納米科技發(fā)展中應用最廣泛的材料之一?，F(xiàn)有的關于SWCNT的毒性

3、研究，多數(shù)集中在SWCNT對組織、臟器及細胞造成的直接損傷方面，對SWCNT通過影響呼吸系統(tǒng)免疫毒性而發(fā)揮間接的心血管毒性效應尚未進行深入的研究。
　　目的：
　　1.研究SWCNT經(jīng)呼吸道暴露后，機體凝血纖溶系統(tǒng)包括脈管系統(tǒng)的變化，闡明該變化與肺臟出現(xiàn)的免疫毒性反應之間的關聯(lián)性。
　　2.探討SWCNT暴露致肺免疫毒性在介導凝血纖溶系統(tǒng)改變中的間接毒性作用及可能的作用機制。
　　方法：
　　在整體動物實驗

4、中，選取雄性Wistar大鼠采用非暴露式氣管滴注方式染毒，隔日染毒一次，分別暴露30天和60天。HE染色法觀察各組大鼠肺組織病理學變化;ELISA法檢測大鼠肺組織、血漿中幾種炎性因子表達水平，包括白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。同時檢測血漿中凝血纖溶相關因子的變化，包括:組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、纖溶酶原活化劑抑制物-1（PAI-1）、D-二聚體(D-dimer)、內(nèi)皮素(ET

5、-1)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、一氧化氮(NO)以及血管性血友病因子(vWF)。透射電鏡觀察大鼠胸主動脈血管內(nèi)膜的損傷情況;免疫組化法檢測血管內(nèi)皮相關因子的表達;RT-PCR法檢測血液中mRNA的表達。
　　在體外細胞實驗中，分別培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細胞株及原代大鼠主動脈血管內(nèi)皮細胞，以肺泡巨噬細胞作為效應細胞，血管內(nèi)皮細胞作為靶細胞，建立體外炎性因子刺激模型和細胞間接暴露模型。觀察SWCNT染毒后細胞形態(tài)學變化;CCK-8法檢測細胞

6、活性;ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液上清中炎性因子及凝血纖溶活化因子表達水平;流式細胞儀檢測ROS水平的變化;Western blot檢測血管內(nèi)皮細胞相關蛋白的表達。
　　結果：
　　一、整體動物實驗
　　1.肺免疫毒性損傷:SWCNT經(jīng)呼吸道分別暴露30天和60天后，大鼠肺部出現(xiàn)病理性改變，局部可見不同程度的棕黑色顆粒物沉積、肺部間質性炎癥;肺組織表達炎性因子IL-1α、IL-6、TNF-α水平與正常對照組相比顯著增加，

7、提示肺組織出現(xiàn)炎性免疫反應。
　　2.血液系統(tǒng)變化:
　　(1) SWCNT經(jīng)呼吸道暴露30天和60天后，大鼠出現(xiàn)不同程度的全身系統(tǒng)性炎癥，表現(xiàn)為血漿中炎性因子IL-1α、IL-6、TNF-α水平升高、白細胞(WBC)、血小板(PLT)釋放增多;同時，血漿粘稠度升高、血中纖維蛋白原(FIB)含量增加。
　　(2)大鼠血漿中凝血纖溶活化因子測定結果顯示，血管內(nèi)皮細胞分泌、合成或釋放AT-Ⅲ、t-PA、TM等因子減少，而合

8、成vWF、TF、ET-1增多，提示血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮凝血和抗凝功能紊亂，甚至血管內(nèi)皮損傷。
　　3.血管內(nèi)皮系統(tǒng)的損傷:
　　(1) SWCNT暴露60天后，染毒組大鼠血管內(nèi)膜層出現(xiàn)細胞核畸形、核質固縮等異常改變，結合病理檢查發(fā)現(xiàn)染毒60天，高劑量組大鼠血管內(nèi)皮細胞周圍有炎細胞浸潤，這些結果提示血管內(nèi)膜受到刺激，并且發(fā)生不同程度的損傷。
　　(2) SWCNT暴露30天和60天后，血管內(nèi)皮表達t-PA抗原明顯降低，同時中

9、、高劑量組大鼠血管內(nèi)膜表達vWF顯著升高，進一步表明并驗證大鼠血管內(nèi)皮細胞的抗血栓功能減弱、內(nèi)皮細胞發(fā)生損傷。
　　4.外周血相關基因的表達:SWCNT暴露60天后，高劑量組大鼠外周血中t-PA基因表達明顯降低而TM基因表達明顯升高，提示它們可能成為SWCNT呼吸道暴露所致大鼠凝血纖溶功能紊亂較為敏感的生物標志基因。同時，高劑量組p38MAPK基因表達亦明顯升高，提示p38MAPK信號轉導途徑可能是參與SWCNT所致機體凝血纖溶活

10、化因子改變的主要作用機制之一。
　　二、體外細胞試驗
　　1.SWCNT對大鼠肺泡巨噬細胞的影響:
　　(1)大鼠肺泡巨噬細胞經(jīng)SWCNT暴露48 h，可見細胞吞噬納米顆粒物質，胞漿內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒，隨著染毒劑量的增加，這種吞噬作用越發(fā)明顯，表現(xiàn)為巨噬細胞聚集并吞噬納米顆粒，當染毒劑量大于50μg/mL時，巨噬細胞聚集成團狀，胞漿內(nèi)幾乎充滿黑色納米顆粒，當染毒劑量達到200μg/mL時，細胞死亡增加，細胞數(shù)量明顯減少。<

11、br>　　(2)隨著SWCNT暴露劑量的增加和暴露時間的延長，肺泡巨噬細胞活性呈降低趨勢。與正常對照組相比，SWCNT暴露24 h、48 h和72 h后，50，100，200μg/mL SWCNT染毒組的細胞活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(3)暴露于75μg/mL和100μg/mL的SWCNT染毒液96 h后，大鼠肺泡巨噬細胞活性氧水平高于正常對照組，其中，SWCNT100μg/mL組活性氧水平與對照組相比顯著升高，差異

12、具有統(tǒng)計學意義。該結果提示SWCNT可通過氧化應激方式，對大鼠肺泡巨噬細胞造成毒性損傷。
　　(4)大鼠肺泡巨噬細胞在SWCNT的刺激下，能夠持續(xù)分泌前炎癥因子IL-1α、IL-6以及TNF-α。隨著暴露時間的延長和染毒劑量的增加，炎性因子IL-1α分泌水平呈增加趨勢。與正常對照組相比，SWCNT50，75，100μg/mL染毒組分別暴露24h、48 h和96 h后，細胞分泌IL-1α水平均顯著高于正常對照組;SWCNT50，75

13、，100μg/mL染毒組分別暴露24 h和48 h后，細胞分泌IL-6水平均顯著高于正常對照組;SWCNT75，100μg/mL染毒組分別暴露48h和96 h后，細胞分泌TNF-α水平均顯著高于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　2.炎性因子對大鼠血管內(nèi)皮細胞分泌凝血纖溶相關因子的影響:利用炎性因子TNF-α刺激大鼠血管內(nèi)皮細胞后，內(nèi)皮細胞分泌凝血纖溶相關因子發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為AT-Ⅲ、t-PA分泌減少，vWF、TF、PAI

14、-1釋放增多，提示血管內(nèi)皮細胞功能受到影響。
　　3.大鼠肺泡巨噬細胞介導的SWCNT間接暴露對大鼠血管內(nèi)皮細胞功能的影響及相關信號轉導通路:
　　(1)血管內(nèi)皮細胞經(jīng)間接暴露模型處理后，各組細胞分泌t-PA的水平均顯著低于正常對照組和SWCNT直接暴露組;而各組細胞分泌PAI-1的水平雖與正常對照組相比顯著升高，但與SWCNT直接暴露組相比，不具有顯著性差異。SWCNT暴露劑量為100μg/mL時，經(jīng)間接暴露模型處理的RA

15、ECs組分泌TF水平顯著高于正常對照組和SWCNT直接暴露組。SWCNT暴露劑量為25和100μg/mL時，經(jīng)間接暴露模型處理后的RAECs分泌AT-Ⅲ的水平與正常對照組和SWCNT直接暴露組相比，均顯著降低。提示肺泡巨噬細胞對血管內(nèi)皮細胞具有一定的介導作用，能夠導致血管內(nèi)皮細胞功能的變化。
　　(2) Western blot試驗結果顯示，經(jīng)間接暴露模型處理后的各組血管內(nèi)皮細胞表達t-PA蛋白的水平明顯低于正常對照組，當SWCN

16、T暴露劑量為75和100μg/mL時，內(nèi)皮細胞表達JNK蛋白的水平顯著高于正常對照組;當SWCNT暴露劑量為100μg/mL時，內(nèi)皮細胞表達磷酸化和非磷酸化p38MAPK水平與正常對照組相比，均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義，提示p38MAPK途徑和JNK途徑可能是參與調(diào)控相關凝血因子的主要通路。
　　結論：
　　1.單壁碳納米管經(jīng)呼吸道暴露可導致大鼠肺臟免疫炎性反應和病理性改變，血管內(nèi)皮損傷及機體凝血纖溶系統(tǒng)功能紊亂。

17、>　　2.SWCNT對體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細胞具有毒性作用，誘導細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生增加及持續(xù)分泌前炎癥因子。而TNF-α可導致血管內(nèi)皮細胞分泌凝血纖溶相關因子發(fā)生改變。
　　3.相對于SWCNT直接暴露而言，通過大鼠肺泡巨噬細胞介導的間接暴露在誘導血管內(nèi)皮功能紊亂方面的作用可能更為顯著。p38MAPK和JNK信號通路可能參與調(diào)控此間接毒性作用。這種間接毒性作用是區(qū)別于以往研究認為的納米材料直接作用的一個重要發(fā)病機制。
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