基于核酸適配體的乳腺癌靶向治療系統(tǒng)的構建及多壁碳納米管間接毒性的體外研究.pdf

1、第一部分，基于核酸適配體的乳腺癌靶向治療研究
　　 乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其中約20～30％為HER2陽性。HER2陽性的乳腺癌侵襲性強，預后差，且易對內(nèi)分泌治療和化療產(chǎn)生抵抗。雖然曲妥珠單抗可以靶向性地治療HER2陽性的乳腺癌，但該治療對相當一部分患者無效，且有效患者中的絕大多數(shù)很快會發(fā)生獲得性耐藥。因此，研發(fā)新型的針對HER2的靶向治療策略，具有較為重大的醫(yī)學意義。核酸適配體(aptamer)在構建新型腫瘤靶向治療

2、體系方面，有較大的應用潛能。但迄今為止，應用HER2適配體來構建乳腺癌靶向治療體系的研究，尚未見文獻報道。本課題利用SELEX技術，以HER2表位肽為靶標，篩選到了一種全新的針對HER2的DNA適配體，以此適配體為基礎構建了靶向HER2的載細胞毒藥物體系，并在體外對該靶向載藥模型進行了初步評估。主要研究工作如下：
　　 1．利用SELEX技術，以HER2表位肽為靶標，以流式細胞術檢測每輪篩選中適配體庫的富集程度和HER2適配體的

3、相對親和力，我們篩選到了一種全新的HER2適配體(HB5)。該適配體含86個堿基，與HER2多肽的親和系數(shù)為18.9nm。
　　 2．為評估適配體HB5與HER2結構的結合特異性，我們以隨機DNA庫作對照，利用流式細胞術評估了FITC標記的HB5與HER2蛋白、胰酶和BSA的結合情況。結果顯示，HB5能夠選擇性的結合HER2蛋白的胞外結構域，但基本不結合BSA和胰酶。
　　 3．為評估適配體HB5與HER2陽性或HER2

4、陰性細胞的結合性質(zhì)，我們將FITC標記的HB5分別與多種HER2陽性或HER2陰性細胞孵育，并行流式細胞術檢測。結果顯示，HB5能夠選擇性的結合HER2陽性的乳腺癌腫瘤細胞系，而基本不結合HER2陰性的細胞系。
　　 4．通過將阿霉素(Dox)嵌入適配體的DNA結構中，我們構建了HER2適配體-陋J霉素(Apt-Dox)靶向載藥系統(tǒng)，并利用阿霉素嵌入DNA結構中后其自發(fā)熒光淬滅的原理，對優(yōu)化該系統(tǒng)的參數(shù)進行了評價。結果顯示，當適

5、配體與阿霉素的摩爾比為0.1時，阿霉素的自發(fā)熒光基本淬滅，提示大部分阿霉素已經(jīng)嵌入HB5的DNA結構并與適配體形成了復合體。
　　 5．為在體外評估Apt-Dox靶向體系的有效性，我們用Apt-Dox，Apt和Dox，分別與HER2陽性或HER2陰性的腫瘤細胞共孵育，利用激光共聚焦顯微鏡、流式細胞術和MTS法進行檢測。結果顯示，Apt-Dox能夠被HER2陽性細胞選擇性地攝入，并且降低了Dox對HER2陰性細胞的殺傷作用(p＜0

6、.05)。
　　 本研究首次以HER2表位肽為靶點，篩選出了能夠結合HER2蛋白及HER2陽性乳腺癌細胞的DNA適配體HB5。相關實驗結果顯示，HER2適配體可以靶向性地將阿霉素帶入HER2陽性的乳腺癌細胞。鑒于多種惡性腫瘤（乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌和膀胱癌等）都可能過量表達HER2，HER2適配體有可能在針對這些腫瘤的新型靶向診療技術方面，具備一定的應用潛能。
　　 第二部分，多壁碳納米管間接毒性

7、的體外研究
　　 碳納米管作為一種重要而有代表性的納米材料，在生物醫(yī)學領域有著廣泛的應用價值，其生物安全性越來越受到關注。免疫系統(tǒng)在疾病發(fā)生過程中會導致組織損傷，因此非常有必要探索碳納米管是否能夠通過影響免疫功能而產(chǎn)生毒性。本研究主要在體外評估了人淋巴細胞介導的碳納米管毒性，發(fā)現(xiàn)低濃度的碳納米管(0．001-0.1ug／ml)不會直接引起明顯的細胞死亡或凋亡，但是能夠增強淋巴細胞介導的細胞毒作用殺傷多種腫瘤細胞系。此外，碳納米管