雌激素核受體在小鼠腰段脊髓表達(dá)特征.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是成年發(fā)病的以大腦運(yùn)動(dòng)皮層、腦干和脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累為特征的神經(jīng)變性疾病。流行病學(xué)顯示，絕經(jīng)期前男性發(fā)病率明顯高于女性，約為3-4∶1，絕經(jīng)后這種差異減小，男女發(fā)病率約為1∶1。研究發(fā)現(xiàn)，雄性SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病時(shí)間早于雌性小鼠，卵巢摘除使小鼠壽命縮短，摘除卵巢后給予雌二醇明顯延緩疾病進(jìn)展。流行病學(xué)研究及實(shí)驗(yàn)研究均提示雌激素對(duì)ALS的發(fā)病及進(jìn)

2、展可能有保護(hù)作用。
　　雌激素(Estrogen，E)是一種甾體類(lèi)固醇性激素。除參與生育、性活動(dòng)外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)雌二醇與其受體(estrogen receptor,ER)包括核受體ERα及β及膜受體GPR30結(jié)合后，調(diào)控基因表達(dá)、激活A(yù)PMK、Akt通路，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，從而發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用。以往的研究多集中于AD、PD及卒中等發(fā)病過(guò)程中雌激素的腦保護(hù)機(jī)制研究，而對(duì)脊髓疾病的保護(hù)機(jī)制則集中于急性脊髓損傷、多發(fā)性硬化

3、及體外的單細(xì)胞保護(hù)的研究，對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。
　　如上所述，雌激素的生物功能主要由與受體結(jié)合后完成，以往研究發(fā)現(xiàn)ERα及ERβ在脊髓主要在后角Ⅰ-Ⅲ層表達(dá)，參與痛覺(jué)調(diào)節(jié)，而在脊髓前角的分布未見(jiàn)系統(tǒng)的描述，為了研究雌激素的保護(hù)機(jī)制需要全面了解其受體的表達(dá)特征。
　　基于此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化及激光共聚焦的方法觀察，雌激素核受體在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠腰段脊髓表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究雌激素在ALS發(fā)病過(guò)程中

4、的神經(jīng)保護(hù)作用提供理論依據(jù)及可能的靶點(diǎn)。本研究分為兩部分，內(nèi)容如下:
　　第一部分ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角的表達(dá)特征
　　目的:觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的表達(dá)。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　成年雄性CD1小鼠
　　2、免疫組化
　　10％水合氯醛將成年雄性小鼠麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，振動(dòng)切片25μm厚

5、，免疫組織化學(xué)法觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的表達(dá)特征。
　　3、免疫熒光染色
　　將固定好的腰段脊髓震蕩切片成25μm厚，應(yīng)用免疫熒光染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:
　　在成年雄性小鼠腰段脊髓，ERα在前角中有表達(dá)，表達(dá)部位主要位于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，且胞核高表達(dá)，胞漿中量表達(dá)。免疫熒光染色證實(shí)是α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。
　　結(jié)論:<

6、br>　　ERα在成年雄性小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的胞核高表達(dá)，在胞漿中量表達(dá)。
　　第二部分ERβ在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠腰段脊髓表達(dá)特征
　　目的:觀察不同病變時(shí)期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠ERβ的表達(dá)特征。
　　方法:
　　1、模型建立及分組
　　飼養(yǎng)繁殖家族性肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠，分為癥狀前期（相當(dāng)于60天）、癥狀期（相當(dāng)于90天）及終末期（相當(dāng)于120天）3組，同窩別未轉(zhuǎn)

7、基因的為對(duì)照組，每組各3只小鼠。
　　2、取材
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)10％水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉后，4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定20min，留取小鼠脊髓腰膨大，在4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫組化染色
　　固定后的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色，觀察ERβ在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及對(duì)照組小鼠各時(shí)期腰段脊髓前角的表達(dá)特征。計(jì)數(shù)雙側(cè)脊髓前角ERβ免疫陽(yáng)性α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量。
　　4、免

8、疫熒光染色
　　4％多聚甲醛固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用免疫熒光染色法進(jìn)行染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓ERβ的細(xì)胞定位。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示腰段脊髓切片兩側(cè)脊髓前角α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)之和，三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn)，以P=0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

9、>　　結(jié)果:
　　1、SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定
　　子代鼠基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后、在GBOX-HR全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下其瓊脂糖凝膠電泳，mSOD1的PCR產(chǎn)物為236bp，若200-300bp之間的有條帶，則該小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠，若無(wú)此條帶，則為非SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠，即陰性小鼠。
　　2、ERβ免疫組化
　　2.1 ERβ在對(duì)照組小鼠脊髓灰、白質(zhì)均有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞核;灰質(zhì)表達(dá)較白

10、質(zhì)更明顯;脊髓后角Ⅰ-Ⅲ層高表達(dá)，脊髓前角廣泛表達(dá)，但表達(dá)密度較低。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠癥狀前期腰段脊髓ERβ的表達(dá)方式及強(qiáng)度與對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別。
　　2.2隨著病情進(jìn)展，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓前角ERβ免疫陽(yáng)性α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少，在癥狀前期、發(fā)病早期、終末期分別為24.30±1.25、14.40±1.50、3.1.±2.28，且各病變時(shí)期間均有顯著性差異(P＜0.05);而對(duì)照組分別為23.40±3.17、24.

11、00±1.70、22.20±1.32，各時(shí)期間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。發(fā)病早期、終末期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　3、免疫熒光染色
　　ERβ在小鼠脊髓前角α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的胞核均有表達(dá)，脊髓前角α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞漿少量表達(dá)。隨病程的進(jìn)展，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓前角ERβ免疫陽(yáng)性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的胞核也有ER