Rac1蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達及其促進膠質(zhì)愛情的代價瘤細胞運動機制的研究.pdf

1、膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、侵襲性最強的惡性膠質(zhì)瘤，屬人類難治性和預后極差的腫瘤之一。盡管采用規(guī)范的標準化治療，但膠質(zhì)母細胞瘤患者預后改善甚微。即使腫瘤實現(xiàn)影像學全切，但膠質(zhì)母細胞瘤術(shù)后常常復發(fā)于腫瘤周圍2cm范圍[1-3]。臨床和病理學證據(jù)表明膠質(zhì)瘤細胞常常沿著細長的解剖結(jié)構(gòu)浸潤播散，如腦白質(zhì)纖維束、微血管和無髓鞘軸突[4]。膠質(zhì)母細胞瘤侵襲遷移的特性是其不良預后的主要

2、原因。因此，越來越多的人意識到靶向抑制調(diào)控膠質(zhì)瘤侵襲遷移的分子將為膠質(zhì)瘤的治療提供新方法。
　　膠質(zhì)瘤細胞的遷移侵襲是一個完整和復雜的多步驟過程，其發(fā)生侵襲需要4個基本步驟，包括①.腫瘤細胞脫離腫瘤實體；②.與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的黏附；③.在基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等作用下降解ECM；④.細胞運動和收縮。在這些步驟中，最為關鍵的環(huán)

3、節(jié)為細胞的遷移運動。作為重要的信號分子，肌動蛋白骨架及其調(diào)控蛋白在膠質(zhì)瘤細胞的運動中發(fā)揮了重要作用[5,6]。Rac1為Ras相關的C3肉毒素底物1的簡稱，其基因全長29 kb，包含7個外顯子，位于人染色體7p22，參與Ras基因的惡性轉(zhuǎn)型。Rac1作為Rho家族成員之一，存在Rac1-GDP（失活狀態(tài)）和Rac1-GTP（激活狀態(tài)）兩種形式,是細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵分子。Rac1作為分子開關參與調(diào)節(jié)一系列的細胞功能,包括細胞增殖

4、、凋亡，腫瘤細胞的侵襲遷移等。片狀偽足的形成和黏著斑的周轉(zhuǎn)作為細胞遷移的兩個關鍵步驟，在細胞的遷移中發(fā)揮重要作用。Rac1不僅參與細胞片狀偽足的形成，而且參與黏著斑的周轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)，被認為是調(diào)控腫瘤細胞侵襲遷移的關鍵因子。相關研究表明，Rac1在上皮性卵巢癌、胃癌、肝細胞癌等腫瘤中過表達并與腫瘤惡性進展密切相關[7-9]。
　　本課題主要研究Rac1在膠質(zhì)瘤中的表達及其促進膠質(zhì)瘤細胞運動機制的研究，包括三個部分：
　　1.人膠質(zhì)瘤

5、組織中Rac1的表達。為研究膠質(zhì)瘤中Rac1的表達及其與膠質(zhì)瘤病理分級的相關性，40例各級別的膠質(zhì)瘤標本以及8例對照腦組織被用于實驗研究。首先，我們運用免疫組化檢測Rac1在不同標本中的表達，結(jié)果證實，Rac1在對照腦組織中不表達，而在膠質(zhì)瘤組織標本中其染色強度隨著腫瘤級別的升高而增強(F=105.225，P=0.000)。
　　接下來，蛋白免疫印跡實驗被用于進一步半定量評估 Rac1在各組織中的表達，結(jié)果為對照腦組織中Rac1的

6、表達量為0.093±0.025(n=8)，而WHO II、WHO III和WHO IV級膠質(zhì)瘤標本中Rac1表達量分別為0.22±0.031(n=8)，0.38±0.031(n=12)，0.61±0.025(n=20)。統(tǒng)計學結(jié)果表明，相比于對照腦組織，Rac1在膠質(zhì)瘤中表達量升高（P<0.01），且與膠質(zhì)瘤的病理分級呈正相關（r=0.92, P=0.012）。
　　2. Rac1在膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲中的作用。我們使用Rac1的

7、特異性的小分子抑制劑NSC23766下調(diào)Rac1的活性，探討Rac1對膠質(zhì)瘤細胞侵襲遷移的影響。U251和 SNB19細胞系用于體外實驗研究,實驗分為2組，即 control組和NSC23766處理組。GST pull-down實驗檢測Rac1活性，MTT實驗檢測NSC23766對膠質(zhì)瘤細胞活性的影響；Transwell侵襲實驗和劃痕實驗分別用于檢測細胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果：Rac1的活性被明顯抑制（P<0.01），抑制Rac1的活性

8、后膠質(zhì)瘤細胞的遷移侵襲能力明顯下降（P<0.01）。
　　3. Rac1促進膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的可能機制。為探究Rac1促進細胞運動的機制，Rac1的小分子抑制劑NSC23766和Rac1特異性的小干擾RNA兩種方法被用于體外實驗研究。細胞免疫熒光觀察細胞形態(tài)的變化及 Rac1與 LIMK1在細胞內(nèi)的定位。Western blotting驗證control、siRNA-NC和Rac1siRNA組Rac1的表達情況。Western

9、 blotting檢測不同處理組P-LIMK1（Thr508）、LIMK1、MMP-2和MMP-9的表達變化。劃痕實驗和Transwell侵襲實驗評價control、Rac1siRNA和 LIMK1siRNA組細胞遷移、侵襲能力的變化。結(jié)果：與 control組相比， NSC23766處理組細胞片狀偽足明顯變小甚至不伸展，此外，NSC23766抑制黏著斑的周轉(zhuǎn)，抑制 LIMK1的磷酸化（P<0.01）。Western blotting結(jié)

10、果顯示， Rac1siRNA能明顯下調(diào)Rac1蛋白的表達。相應地，沉默Rac1的表達可得到相似的結(jié)果。免疫熒光結(jié)果顯示Rac1與LIMK1共定位于細胞前緣的片狀偽足處。抑制Rac1的活性后MMP-2、MMP-9的表達明顯下調(diào)（P<0.01）。與control組相比，Rac1siRNA與LIMK1siRNA組細胞遷移和侵襲能力明顯下降（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.與對照腦組織相比，Rac1在膠質(zhì)瘤組織中的表達明顯升高