集中空調系統(tǒng)中弗朗西斯菌樣細菌的多相分類學研究和另弗朗西斯菌屬的建立.pdf

1、目的：
　　弗朗西斯菌屬(Francisella)細菌是一種兼性細胞內寄生的革蘭陰性菌球桿菌。該菌屬模式菌種—土拉弗朗西斯菌，具有高度的致病能力和通過氣溶膠傳播的特性，被認為是一種潛在的生物恐怖細菌。其他的弗朗西斯菌種通常被認為是環(huán)境菌種、非致病菌或者機會性致病菌。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，弗朗西斯菌廣泛存在于自然界的淡水、咸水源和土壤中，其中人工供水系統(tǒng)中集中空調冷卻水是一個新發(fā)現(xiàn)的生境。本研究旨在采用多相分類的方法，對分離自空調冷卻水

2、的弗朗西斯菌樣細菌（SYSU10HL1970、10HP457、10HL1938、10HP82-10、SYSU YG23）進行生理生化、化學和分子生物學鑒定，確定其分類地位，便于評估其毒力、致病性和通過集中空調系統(tǒng)傳播疾病的能力。
　　方法：
　　1.經(jīng)典分類
　　采用傳統(tǒng)實驗方法進行氧化酶、觸酶實驗和 H2S還原實驗等實驗，以及采用API20NH、API ZYM和RapidID32A的試劑盒進行生化實驗，E-test法

3、檢測抗生素敏感性。選擇科內相近種的典型菌株 F. philomiragia ATCC25015、F. guangzhouensis08HL01032T作為參比菌株與供試菌株做平行實驗，進行比較分析。
　　2.化學分類
　　采用薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜方法測定供試菌株的極性脂、呼吸醌、脂肪酸組分，選擇科內相近種的典型菌株F. philomiragia ATCC25015、F. guangzhouensis08HL010

4、32T作為參比菌株與供試菌株做平行實驗，以比較分析。
　　3.分子分類
　　采用高效液相色譜（基因組DNA G+C mol％含量分析）、蛋白質譜、PCR擴增和基因測序相結合的核酸分析、DNA-DNA雜交等技術對供試菌株進行分子分類。根據(jù)分子分類的結果，該五株菌分類為2個菌群，SYSU YG23T和SYSU10HL1970T分別被指定為模式菌株（Type strain）。
　　結果：
　　1.經(jīng)典分類
　　S

5、YSU YG23T、SYSU10HL1970T、10HP457、10HL1938、10HP82-10五個供試菌株符合弗朗西斯菌科細菌的基本特征，其均為革蘭氏陰性球桿菌，氧化酶陰性、觸酶弱陽性且 L-半胱氨酸能促進其生長（CHAB培養(yǎng)基和嗜血桿菌巧克力培養(yǎng)基上菌落大于血平板）。具有與弗朗西斯菌科細菌類似的藥敏特征：β-內酰酶試驗陽性，對頭孢菌素耐藥，對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類抗生素敏感。總體生化特征類似于廣州弗朗西斯菌，但存在一定

6、差異，如蔗糖發(fā)酵、亮氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、苯丙氨酸芳胺酶。
　　2.化學分類
　　SYSU YG23T、SYSU10HL1970T、10HP457、10HL1938和10HP82-10五個供試菌株的極性脂和醌組主要組分相同，主要含有磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）、雙磷脂酰甘油（diphosphatidylglycerol, DPG）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycer

7、ol, PG）、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine, PC)、含氨基的未知磷脂（unidentified aminophospholipid, APL4，APL2）、未知磷脂（PL2, PL3和PL4）、未知糖脂（GL2）和少量的未知糖脂（GL1，GL3）。呼吸醌類型是Q-8，主要脂肪酸成分是C10:0、C14:0、C16:0和兩個長鏈羥基脂肪酸C18:1ω9c和C18:13-OH，但在脂肪酸含量和種類上與參考菌株稍有不

8、同，而且 SYSU YG23T和其它四個供試菌株在主要脂肪酸含量上有所區(qū)別，且 SYSU YG23T和其它四個供試菌株在主要脂肪酸含量上有所區(qū)別。
　　3.分子分類
　　16S rRNA基因比對結果顯示：SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457的相似度為100%，與SYSU YG23T之間的相似度為98.6%；且兩者與廣州弗朗西斯菌08HL01032T的相似度最高，分別為98.87%和

9、98.82%，但都與其他弗朗西斯菌種的相似度低于95.3%。以 MP、NJ和 ML三種方法構建的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示：該5株菌與廣州弗朗西斯菌位于一個大的分枝上，與廣州弗朗西斯菌分別形成3個小枝，其中SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457形成一個進化枝，SYSU YG23T單獨為一個枝。
　　管家基因mdh、rpoB和 sdhA擴增成功，長度分別是700bp、300bp和3

10、00bp。基于單個管家基因及串聯(lián)管家基因的系統(tǒng)發(fā)育樹一致且與基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹一致。即三個管家基因測序分析的結果亦表明，該五株可分為2個進化群，其分別與廣州弗朗西斯菌親緣關系密切，但又與廣州弗朗西斯菌存在明顯的差異。
　　MALDI-TOF MS的分析結果顯示，SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457和存在特征的蛋白質譜峰5110m/z、6123m/z、9360m/z；SY

11、SU YG23T存在特征的蛋白質譜峰5110m/z、4754m/z、6123m/z、9360m/z，且在4754m/z有峰，相對強度大于5110m/z峰相對強度。聚類分析顯示，SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457形成一個聚類群，SYSU YG23T單獨為一個聚類群。
　　基于細菌全基因組的分析結果顯示：SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457四株菌

12、之間的雜交率>80%，即該四株菌為同一個種；與SYSU YG23T的雜交率在低于70%，即該四株菌與SYSU YG23T分別屬于兩個不同的菌種。另外，該五株菌與已知親緣關系接近的廣州弗朗西斯菌08HL01032T和蜃樓弗朗西斯菌也低于70%，亦支持其新屬新種的分類地位。該兩個新屬新種的G+C mol%含量分別為：SYSU10HL1970T的G+C mol%含量為30.0%，SYSU YG23T的G+C mol%含量為32.6%。

13、　　結論：
　　根據(jù)經(jīng)典分類、化學分類和分子分類的試驗結果，SYSU10HL1970T（=KCTC42969= DSM101835）、10HL1938、10HP82-10、10HP457四株菌和SYSUYG23T（= KCTC42968=DSM101834)為弗朗西斯菌科的兩個新屬新種。根據(jù)細菌新種的命名法則，分別命名為冷卻水另弗朗西斯菌（Allofrancisella frigidaquae）和意外另弗朗西斯菌（Allofran