納米顆粒的核酸遞送功能及安全應(yīng)用評(píng)價(jià)研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 陽離子化明膠微球介導(dǎo)CXCR4 siRNA在腫瘤細(xì)胞中的RNA干擾研究
　　目的:RNA干擾(RNAi)對(duì)于人類基因相關(guān)疾病的治療，特別是抗腫瘤治療具有重要的意義。迄今RNAi的作用機(jī)理已經(jīng)非常明晰，并且有多種核酸藥物(siRNA、shRNA、miRNA、dsiRNA)和核酸遞送載體（病毒、脂質(zhì)體、陽離子聚合物、金屬或無機(jī)納米顆粒等）得到廣泛關(guān)注與研究。常用的核酸遞送載體主要包括

2、病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)染率高，但存在核酸裝載量有限以及具有免疫原性和安全性風(fēng)險(xiǎn)等問題;非病毒載體安全、穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。因此，構(gòu)建安全、高效的非病毒核酸遞送載體是RNAi技術(shù)研發(fā)中面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。明膠來源于動(dòng)物的皮膚和骨骼，可生物降解，并具有生物相容性好和易被化學(xué)修飾等特點(diǎn)，是制備藥物載體的一種重要生物材料。本課題的總體思路是合成陽離子化明膠分子，對(duì)傳統(tǒng)兩步溶解法進(jìn)行改進(jìn)，制備出尺寸分布均一的陽離子化明膠微球(ca

3、tionic gelatin nanoparticles，CGN);其目的是保護(hù)核酸物質(zhì)免于核酸酶降解，同時(shí)，實(shí)現(xiàn)核酸藥物緩釋而延長(zhǎng)其作用時(shí)間。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究陽離子化明膠分子的交聯(lián)度、培養(yǎng)基中血清濃度以及細(xì)胞種類等因素對(duì)陽離子化明膠微球介導(dǎo)CXCR4 siRNA發(fā)揮干擾效果的影響規(guī)律。
　　方法:通過向明膠分子中導(dǎo)入乙二胺制備陽離子化明膠;以戊二醛為交聯(lián)劑，通過對(duì)傳統(tǒng)兩步溶解法進(jìn)行改進(jìn)來制備不同交聯(lián)度的陽離子化明膠微球(CGN)

4、，并以非陽離子化明膠微球(gelatin nanoparticles，GN)作為對(duì)照。采用掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)等方法對(duì)CGN形貌、尺寸及其在水溶液中的水合粒徑、Zeta電位等參數(shù)進(jìn)行表征和檢測(cè)。使用1％瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)CGN與siRNA的結(jié)合，采用DLS法檢測(cè)CGN與siRNA復(fù)合物（CGN@siRNA）的水合粒徑和Zeta電位。采用CCK8法檢測(cè)GN、CGN、CGN@siRNA對(duì)小

5、鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的細(xì)胞毒性，以及血清含量對(duì)細(xì)胞活性的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CGN@siRNA的細(xì)胞攝取情況;通過激光共聚焦顯微鏡(confocal)觀察CGN@siRNA在細(xì)胞中的定位。采用Real Time PCR方法在腫瘤細(xì)胞株上檢測(cè)和評(píng)價(jià)交聯(lián)度、血清濃度以及細(xì)胞種類對(duì)CGN介導(dǎo)的CXCR4 siRNA干擾效率的影響規(guī)律。
　　結(jié)果:(1)制備了五種不同交聯(lián)度的CGN; SEM結(jié)果顯示，CGN為形貌規(guī)整的球形，尺寸均一;隨

6、著交聯(lián)度的增加，CGN的平均粒徑依次為488±103.17、412±67.93、328±68.34、297±64.80、280±72.08nm;在水溶液中，相應(yīng)的水合粒徑依次為652±10.61、533±2.83、375±7.07、367±7.08、358±3.54 nm; Zeta電位均在+40 mV左右，表明CGN表面帶正電。(2)凝膠電泳結(jié)果顯示，當(dāng)CGN與siRNA質(zhì)量比大于4以后，兩者能夠完全結(jié)合。(3) CCK8法檢測(cè)結(jié)果表

7、明，CGN對(duì)4T1細(xì)胞的毒性作用具有濃度依賴性和尺寸效應(yīng);而GN和CGN@siRNA的細(xì)胞毒性要低于CGN;另外，培養(yǎng)基中血清濃度降低會(huì)使CGN@siRNA的細(xì)胞毒性增大。(4)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，交聯(lián)度越大，CGN@siRNA進(jìn)入4T1細(xì)胞的能力越強(qiáng);血清濃度越低，越有利于細(xì)胞對(duì)CGN@siRNA的攝取;不同種類細(xì)胞對(duì)CGN@siRNA的攝取也各不相同。(5)Confocal觀察結(jié)果表明，CGN@siRNA進(jìn)入細(xì)胞后主要分布在溶酶

8、體中。(6) Real time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CGN與CXCR4 siRNA復(fù)合物(CGN@siCXCR4)能有效沉默4T1細(xì)胞CXCR4的表達(dá)，干擾效率接近商用載體Lipofectamine3000;沉默效果可持續(xù)96 h，并與CGN交聯(lián)度相關(guān);降低培養(yǎng)基血清濃度有利于增強(qiáng)干擾效率;此外，CGN@siCXCR4在其他不同種類的腫瘤細(xì)胞中的干擾效果不同。
　　結(jié)論:陽離子化明膠微球可在多種腫瘤細(xì)胞株上有效介導(dǎo)CXCR4的R

9、NA干擾，并且基因沉默時(shí)間長(zhǎng)，可實(shí)現(xiàn)siRNA的緩釋，是一種很有潛力用于抗腫瘤治療的siRNA遞送載體。
　　第二部分 納米銀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究
　　目的:納米銀(AgNPs)優(yōu)越的抗菌性吸引了人們對(duì)食品、農(nóng)業(yè)、家用電器、紡織用品、醫(yī)療器械和環(huán)境保護(hù)等多領(lǐng)域產(chǎn)品的研發(fā)興趣。但是隨著在日常生活中的廣泛暴露，納米銀帶來的安全、環(huán)境和健康等問題也引起了學(xué)術(shù)界和相關(guān)監(jiān)管部門的密切關(guān)注。研究顯示，納米銀通過靜脈注射、口服、吸入等

10、暴露途徑進(jìn)入生物體后，在心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸等器官中都有分布，主要通過作用于生物膜、誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS、損傷核內(nèi)DNA以及釋放Ag+等途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死細(xì)胞，由此導(dǎo)致全身毒性。目前關(guān)于納米銀對(duì)血管內(nèi)皮作用的研究主要集中在細(xì)胞毒性方面，關(guān)于其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間相互連接的影響以及與銀離子細(xì)胞毒性機(jī)制的差異目前還不完全清楚。本課題在原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞上探究納米銀和硝酸銀對(duì)血管內(nèi)皮連接的影響以及兩者產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制差異，并采用尾靜

11、脈暴露方式觀察小鼠血管外周組織的病理改變，驗(yàn)證兩者對(duì)血管內(nèi)皮完整性的影響及其所引起的全身毒性。
　　方法:本研究選用三種不同尺寸AgNPs（10、75、110 nm），初始濃度為1 mg/mL，表面由2 mM檸檬酸鈉包被，設(shè)AgNO3作為對(duì)照。在材料表征方面，采用透射電鏡(TEM)觀察AgNPs的形貌和尺寸分布;通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)AgNPs的水合粒徑和Zeta電位。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作

12、為研究對(duì)象，通過CCK8法檢測(cè)AgNPs和AgNO3對(duì)細(xì)胞活性的影響;利用Hoechst/PI雙熒光染色法觀察兩者引起的細(xì)胞凋亡和壞死情況;使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）檢測(cè)HUVEC細(xì)胞內(nèi)銀元素含量，評(píng)價(jià)AgNPs和AgNO3的細(xì)胞攝取情況。采用TEM和能譜色散儀(EDX)對(duì)AgNPs在細(xì)胞內(nèi)的定位進(jìn)行分析。通過激光共聚焦掃描電鏡(confocal)觀察AgNPs或AgNO3作用后細(xì)胞的鈣粘蛋白(VE-cadherin)和

13、肌動(dòng)蛋白(Actin)表達(dá)水平，探究?jī)烧邔?duì)內(nèi)皮細(xì)胞間連接和細(xì)胞骨架的影響。通過流式細(xì)胞檢測(cè)儀和熒光顯微鏡檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，評(píng)價(jià)兩者引起的胞內(nèi)ROS水平改變。在體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，通過多次尾靜脈注射AgNPs或者AgNO3到小鼠體內(nèi)，收集小鼠肝臟、腎臟和肺組織，利用顯微鏡觀察AgNPs引起的病理改變情況;通過TEM觀察AgNPs在肝臟、腎臟和肺中的分布。
　　結(jié)果:(1)理化表征結(jié)果顯示，三種尺寸的AgNPs均呈顆粒狀分布，尺寸均一

14、;粒徑大小為11±1、76±6和107±8 nm。在水溶液中的水合粒徑分別為9.8±3.2、72.0±0.9、99.3±1.7 nm;在5％葡萄糖溶液中分別為10.7±3.3、78.9±0.9、116.8±2.6 nm;在完全培養(yǎng)基中靜置至48 h后，粒徑分別為12.6±3.9、104.6±0.2、147.0±1.7 nm，說明AgNPs能穩(wěn)定的分散在水溶液、5％葡糖糖以及完全培養(yǎng)基中。在水溶液中的Zeta電位依次為-42.3±1.4、

15、-45.5±0.7、-44.5±0.4 mV;在5％葡萄糖中依次為-35.7±0.1、-38.2±1.1、-37.7±0.6 mV;在完全培養(yǎng)基中靜置48 h后依次為-7.9±0.5、-8.0±1.1、-7.2±1.0mV，說明AgNPs表面均帶負(fù)電。(2) AgNPs的細(xì)胞毒性具有濃度依賴性和尺寸效應(yīng)，主要引起細(xì)胞凋亡;AgNO3的毒性作用明顯強(qiáng)于AgNPs，主要引起細(xì)胞壞死。(3)AgNPs能夠被HUVEC細(xì)胞大量攝取并且分布在溶酶

16、體中;而AgNO3不能被細(xì)胞攝取。(4) AgNPs作用于HUVEC細(xì)胞后使胞內(nèi)ROS水平顯著升高，能減少內(nèi)皮細(xì)胞間連接并且破壞細(xì)胞骨架完整性;AgNO3沒有引起上述現(xiàn)象。(5)抗氧化劑NAC提前處理細(xì)胞能降低AgNPs引起的胞內(nèi)ROS升高水平，削弱AgNPs導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞間連接減少現(xiàn)象，降低AgNPs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用。(6)多次尾靜脈注射AgNPs引起小鼠肝臟、腎臟和肺組織中血管周圍炎癥細(xì)胞聚集，產(chǎn)生明顯血管周圍炎癥反應(yīng)，而A