甘薯水溶性糖蛋白的分離及高效凝膠色譜測(cè)定方法研究.pdf

1、糖蛋白是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子化合物，具有多種生物活性，在生物體內(nèi)起著重要作用。本論文以甘薯為原料，采用色譜、凝膠電泳和紅外掃描等技術(shù)對(duì)甘薯水溶性糖蛋白的分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究；同時(shí)以牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖標(biāo)樣(DT70)和提取的甘薯水溶性糖蛋白等為樣品建立了高效凝膠色譜分離(HPGC)、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)串聯(lián)測(cè)定水溶性糖蛋白的方法。 結(jié)論： (1)通過(guò)單因素試

2、驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了甘薯水溶性糖蛋白的最佳提取條件：料液比為1：25、提取溫度為40℃、提取時(shí)間為1h、pH為9，蛋白提取率為2.49％。該水溶性糖蛋白為白色絮狀，易溶于水，難溶于甲醇，乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑；分子量為66，000Da；蛋白質(zhì)含量為88.23％，糖含量為11.75％；它含有非淀粉類多糖，乙酰氨基、吡喃糖環(huán)以及α型糖苷鍵。β-消除反應(yīng)后，紫外掃描顯示在240nm處有明顯的吸收峰，說(shuō)明其為O-糖蛋白。0.1um孔徑的濾膜可將甘薯

3、水提取物中的大部分糖蛋白截留。甘薯水溶性糖蛋白體外生物活性實(shí)驗(yàn)表明：它具有較好的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。 (2)采用HPGC-DAD-ELSD串聯(lián)檢測(cè)水溶性糖蛋白的色譜條件為：純水做流動(dòng)相，流速為0.5ml/min，柱溫溫度為30℃，漂移管溫度為80℃，載氣壓力為0.35Psi。 (3)采用HPGC-DAD-ELSD串聯(lián)對(duì)BSA和DT70定性、定量分析表明：對(duì)非結(jié)合態(tài)蛋白和多糖而言，經(jīng)HPGC分離后，雖然ELSD色譜圖上顯

4、示兩個(gè)色譜峰，但是根據(jù)DAD色譜圖有無(wú)色譜峰及保留時(shí)間，可以對(duì)BSA和DT70進(jìn)行定性判定。定量分析表明，BSA在280nm時(shí)，峰高和濃度取對(duì)數(shù)得的線性方程的相關(guān)系數(shù)最高：R2=0.9999，公式為：LogA=0.9488LogC+3.4377；在ELSD色譜圖上峰面積和濃度取對(duì)數(shù)的線性方程的相關(guān)性較好：R2=0.9981，公式為：LogA=1.3649LogC+6.6932。DT70在ELSD色譜圖上峰高和濃度取對(duì)數(shù)的線性方程相關(guān)性較

5、好：R2=0.999，公式為：LogA=0.9139LogC+6.2925。BSA和DT70的加標(biāo)回收率在95％～103％范圍內(nèi)，最小檢測(cè)限分別為50ng，24ng，精密度較好，變異率均較小。檢測(cè)器串聯(lián)先后順序?qū)е屡Ｑ灏椎鞍自贓LSD色譜圖上保留時(shí)間比DAD色譜圖上保留時(shí)間滯后0.13s。 (4)HPGC-DAD-ELSD串聯(lián)對(duì)純化甘薯水溶性糖蛋白定性、定量分析表明：經(jīng)HPGC分離后在DAD和ELSD色譜圖上都僅得到一個(gè)色譜

6、峰，說(shuō)明該物質(zhì)是蛋白和糖共價(jià)結(jié)合態(tài)。甘薯水溶性糖蛋白在給定的濃度范圍內(nèi)，在DAD色譜圖上215-225nm峰高差與濃度取對(duì)數(shù)所得線性方程為：LogA=1.4051LogC+1.124，ELSD色譜圖上峰面積與濃度的線性方程為：y=2E+09x-5E+06，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.9998和R2=0.9982，均大于0.99，線性關(guān)系良好。甘薯水溶性糖蛋白加標(biāo)回收率在92％～103％范圍內(nèi)。其最小檢測(cè)限為18ng。該方法的精密度較好，變異