HCV感染者病毒基因型、NS5B區(qū)耐藥相關(guān)變異及其耐藥屏障分析.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起慢性肝炎主要病原體之一，全球有1.85億丙肝病毒感染者，約占世界人口的3％，我國(guó)丙肝感染率為3.2%。2014年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委統(tǒng)計(jì)的新發(fā)病人數(shù)為20.3萬(wàn)，發(fā)病率0.43%，與2013年比有下降趨勢(shì)，但我國(guó)現(xiàn)已有幾千萬(wàn)HCV感染者。感染HCV后僅約20％患者可實(shí)現(xiàn)病毒清除，大多數(shù)患者將終生攜帶HCV，丙肝比乙肝更容易發(fā)展成慢性肝炎、肝硬化及肝癌。HCV感染已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共

2、衛(wèi)生問(wèn)題。
　　不同地區(qū)HCV基因型不同，不同HCV基因型所致的肝炎標(biāo)準(zhǔn)治療方案不同，了解我國(guó)或某地區(qū)的HCV基因型將有助于HCV的流行病學(xué)調(diào)查和丙肝治療方案的選擇；耐藥點(diǎn)監(jiān)測(cè)是發(fā)揮直接抗病毒藥物療效、節(jié)約成本的關(guān)鍵，也是類(lèi)似藥物開(kāi)發(fā)前的必修課，了解我國(guó)HCV序列耐藥位點(diǎn)堿基及氨基酸多態(tài)性，有助于指導(dǎo)HCV NS5B區(qū)抑制劑的開(kāi)發(fā)、引進(jìn)和使用。
　　1．中國(guó)丙型肝炎病毒基因型分布的系統(tǒng)回顧及meta分析
　　目的：了解

3、我國(guó)丙型肝炎病毒基因型分布特點(diǎn)
　　方法：檢索pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)醫(yī)院知識(shí)庫(kù)以及中國(guó)生物醫(yī)學(xué)獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，收集2012年1月至2014年12月公開(kāi)發(fā)表的有關(guān)中國(guó)丙型肝炎病毒基因型的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行系統(tǒng)回顧及meta分析。
　　結(jié)果：我國(guó)HC V亞型仍以1b為主，但6a亞型已經(jīng)超過(guò)2a成為第二大亞型，3b和3a在構(gòu)成比上有增加的趨勢(shì)，其他亞型也在明顯增加；由于我國(guó)地域廣闊，各地區(qū)間亞型分布差別較大，很難對(duì)各亞型進(jìn)行匯

4、總分析。
　　結(jié)論：我國(guó)的HCV亞型有多樣化發(fā)展趨勢(shì)；預(yù)防部門(mén)在制定丙肝的防控措施時(shí)應(yīng)該考慮地域因素的差異。
　　2．用生物信息學(xué)方法確定最能替代HCV全基因組分型的最佳區(qū)域
　　目的：確定最能替代HCV全基因組分型的區(qū)域，為簡(jiǎn)化HCV全基因組分型提供理論依據(jù)。
　　方法：從丙肝數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得c ore區(qū)、E1區(qū)、E2區(qū)和NS5B區(qū)常用測(cè)序區(qū)序列，分別建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
　　結(jié)果：co re區(qū)構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)

5、化樹(shù)顯示未能把C亞型和A亞型分開(kāi)，1CAY651061位于1A中；E1區(qū)未把A亞型與B亞型分開(kāi)，1B AY746882位于1A中，1A AY388455位于1B中；E2區(qū)未把A亞型與C亞型分開(kāi)，1A E U529679位于1C中；NS5B區(qū)序列和全基因組序列均正確分類(lèi)顯示。
　　結(jié)論：確定最能替代HC V全基因組分型的最佳區(qū)域?yàn)镹S5B區(qū)。
　　3．中國(guó)HCV NS5B區(qū)耐藥相關(guān)變異及其耐藥基因屏障分析
　　目的：了解

6、我國(guó)丙肝患者HCV NS5B區(qū)抑制劑各耐藥點(diǎn)氨基與堿基多態(tài)性；了解我國(guó)現(xiàn)有天然HCV序列在sofosbuvi藥物（NS5B RdRp抑制劑）壓力下發(fā)生堿基突變從而產(chǎn)生耐藥氨基酸的難易程度。
　　方法：我們通過(guò)文獻(xiàn)獲得耐藥位點(diǎn)，通過(guò)基因庫(kù)獲得我國(guó)HCV NS5B區(qū)序列，并分析這些序列在耐藥點(diǎn)上的堿基和氨基酸多態(tài)性；我們對(duì)已納入歐美慢性丙肝標(biāo)準(zhǔn)治療方案的NS5B區(qū)抑制劑sofosbuvir耐藥位點(diǎn)S96T和S282T進(jìn)行耐藥基因屏障分

7、析。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)17個(gè)耐藥位點(diǎn)有8個(gè)未見(jiàn)原始耐藥氨基酸，但有9個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)耐藥氨基酸，集中在316、424、482、494四個(gè)位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)96號(hào)位置100%的序列可通過(guò)1個(gè)密碼子的轉(zhuǎn)變出現(xiàn)耐藥氨基酸，282號(hào)位置有99.7%可通過(guò)1個(gè)密碼子的轉(zhuǎn)變出現(xiàn)耐藥氨基酸，而且耐藥屏障評(píng)分均為1分。
　　結(jié)論：我國(guó)引進(jìn)和開(kāi)發(fā)針對(duì)NS5B區(qū)的抑制劑時(shí)，應(yīng)避免針對(duì)316、424、482、494四個(gè)位點(diǎn)的藥物；我國(guó)HCV序列在sofosbuv

8、ir藥物壓力下產(chǎn)生耐藥氨基酸是比較容易的，該類(lèi)藥物的引入需要慎重。
　　4．四川省HCV基因亞型流行情況及其耐藥基因屏障分析
　　目的：了解四川三地HCV基因亞型流行情況及耐藥點(diǎn)氨基多態(tài)性
　　方法：經(jīng)過(guò)臨床陽(yáng)性標(biāo)本篩選、NS5B區(qū)PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒構(gòu)建擴(kuò)增、測(cè)序，獲得HCV NS5B區(qū)序列。對(duì)這些測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步建樹(shù)分型、耐藥點(diǎn)基因屏障分析，從而了解四川三地HCV序列耐藥點(diǎn)氨基酸多態(tài)性和282號(hào)突變點(diǎn)基因耐藥屏障情況。<

9、br>　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)宜賓和瀘州均是以3b和1b為主，宜賓和瀘州各亞型構(gòu)成比極為相似，而成都以1b和3b為主；四川三地HC V序列在15個(gè)耐藥點(diǎn)中有6個(gè)出現(xiàn)了耐藥氨基酸；282號(hào)氨基酸密碼子（AGC、AGU）均可通過(guò)1個(gè)密碼子突變轉(zhuǎn)換為耐藥氨基酸，而且耐藥屏障評(píng)分均為1分。
　　結(jié)論：在開(kāi)發(fā)和引進(jìn)NS5B區(qū)抑制劑時(shí)應(yīng)避免以316號(hào)、365號(hào)、414號(hào)、424號(hào)、482號(hào)和494號(hào)為靶點(diǎn)的藥物；在sofosbuvir藥物壓力下四川省丙