馬利筋新型C21甾體化合物Asclepiasterol逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐藥的作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的：P-glycoprotein（P-gp）介導的腫瘤多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）是目前導致臨床藥物治療腫瘤失敗的一個重要原因。以P-gp為代表的ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白通過ATP水解釋能將不同類型及作用機理的抗腫瘤藥物外排至細胞外，導致腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度急劇下降，達不到治療閥值，最終形成腫瘤多藥耐藥。目前，攻克P-gp介導腫瘤多藥耐藥最為理想有效的方法是通過外源性化合物干擾P-gp在耐藥腫瘤組織中

2、的表達水平或者抑制其外排抗腫瘤藥物的功能，從而恢復耐藥腫瘤細胞對于相應抗腫瘤藥物的敏感性，此類的干預措施稱為P-gp抑制劑或者逆轉(zhuǎn)耐藥劑。自從第一代P-gp抑制劑維拉帕米（VRP）和環(huán)孢菌素A（CsA）被開發(fā)以來，不同化學結(jié)構和來源的化合物相繼被證實具有逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐藥的作用，其中有不少候選化合物進入臨床前以及臨床研究。但相關臨床前及臨床試驗研究結(jié)果表明，絕大多數(shù)的候選逆轉(zhuǎn)耐藥劑在干預腫瘤多藥耐藥過程中存在著明顯的臟器毒性以

3、及改變相關抗腫瘤藥物體內(nèi)藥代動力學特征等副作用，限制了其進入臨床使用。因此，目前還沒有一個成熟的P-gp抑制劑通過臨床試驗III期研究，應用于克服腫瘤多藥耐藥。
　　天然產(chǎn)物因其結(jié)構多樣性以及新穎性，常作為新一代高效、低毒P-gp抑制劑的候選化合物來源。隨著天然產(chǎn)物分離以及結(jié)構鑒定技術的發(fā)展，越來越多具有較低副作用和良好耐受性的天然中藥提取分離產(chǎn)物被報道證實具有體內(nèi)體外逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐藥的作用。目前，研究報道具有逆轉(zhuǎn)活性

4、的天然來源化合物主要為黃芩素及其衍生物、色胺酮類、生物堿類、生物萜類類等。在2015年，許多研究團隊報道化學合成的強心甾類化合物具有體外逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐藥的活性。為了拓展天然產(chǎn)物來源P-gp抑制劑的研究領域，課題組前期對天然蘿藦科植物馬利筋（Asclepias curassavia）提取分離得到的一系列強心甾類及C21甾體類化合物的逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐藥活性進行篩選，初步發(fā)現(xiàn)C21甾體類化合物Asclepiasterol

5、具有明顯抑制P-gp介導腫瘤多藥耐藥的活性?；诖?，本研究在進一步確證Asclepiasterol逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐藥活性的基礎上，重點解析其內(nèi)在的作用機制和相關作用靶點，以期為該新型候選化合物的進一步研究開發(fā)提供有用的實驗數(shù)據(jù)。
　　研究方法：本研究主要從P-gp藥物外排功能、P-gp在耐藥腫瘤細胞中表達水平以及P耐藥腫瘤細胞中P-gp轉(zhuǎn)錄后修飾相關作用點三個層次考察Asclepiasterol逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐

6、藥的作用及其機制：
　　1.采用MTT實驗檢測Asclepiasterol對相關耐藥腫瘤細胞（MCF-7/ADR、HepG-2/ADM、K562/ADR及K562/ADM）及其相應母源敏感細胞（MCF-7、HepG-2及K562）、非腫瘤細胞HEK293、LO2和Chang等細胞增殖的影響，從而確定考察逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的最佳濃度；
　　2.采用MTT實驗和CCK-8實驗檢測Asclepiasterol是否增強P-gp陽性表達

7、腫瘤細胞對相應抗腫瘤藥物阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素以及紫杉醇敏感性；
　　3.采用AnnexinV/PI實驗檢測Asclepiasterol對紫杉醇所介導的耐藥腫瘤細胞凋亡狀況的影響；
　　4.采用軟瓊脂克隆形成實驗檢測阿霉素聯(lián)合使用Asclepiasterol對耐藥腫瘤細胞克隆形成能力的影響；
　　5.采用Western Blotting實驗和Real-Time PCR實驗檢測Asclepiasterol對耐藥腫瘤細

8、胞蛋白表達和相關基因表達的影響；
　　6.采用P-gp ATPase systems試劑盒檢測Asclepiasterol對P-gp外排底物功能的影響。
　　7.采用流式細胞術檢測Asclepiasterol干預之后，P-gp特異性熒光底物和阿霉素在耐藥腫瘤細胞中蓄積情況的變化；
　　8.采用基因沉默技術和相關蛋白抑制劑及激動劑干預考察相應蛋白靶點與P-gp在耐藥腫瘤細胞中表達的相互作用；
　　9.采用免疫共沉淀

9、技術考察Asclepiasterol對P-gp在耐藥腫瘤細胞內(nèi)泛素化降解的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.細胞增殖實驗結(jié)果表明，Asclepiasterol在最高濃度10.0μM處理模式耐藥腫瘤細胞MCF-7/ADR、HepG-2/ADM、K562/ADR及K562/ADM、野生型敏感腫瘤細胞MCF-7、HepG-2和K562以及非腫瘤細胞HEK293、LO2、Chang細胞48h后沒有顯現(xiàn)出明顯的細胞毒性，并且模式耐藥腫瘤

10、細胞及其野生型敏感腫瘤細胞在5.0μM Asclepiasterol干預下，細胞存活率均為95％左右。
　　2.P-gp陽性表達的模式耐藥腫瘤細胞在沒有明顯細胞毒性濃度的Asclepiasterol（2.5和5.0μM）干預下，恢復了對其相應外排底物抗腫瘤藥物阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素及紫杉醇的敏感性。
　　3.Asclepiasterol增強P-gp底物抗腫瘤藥物紫杉醇誘導模式耐藥腫瘤細胞發(fā)生凋亡的作用；Asclepias

11、terol與阿霉素 Dox聯(lián)合使用處理模式耐藥腫瘤細胞可以顯著性地降低其惡性增殖的能力。
　　4.Asclepiasterol增強模式耐藥腫瘤細胞對P-gp特異性熒光底物Rh123和阿霉素Dox的蓄積作用。
　　5.Asclepiasterol在沒有影響模式耐藥腫瘤細胞中多藥耐藥基因ABCB1/MDR1表達的前提下，顯著性地下調(diào)了多藥耐藥蛋白P-gp在耐藥細胞中的表達水平。
　　6.Asclepiasterol在短期（

12、4h）處理模式耐藥腫瘤細胞后能夠影響Rh123在耐藥細胞中的蓄積水平，P-gp ATPase實驗結(jié)果表明Asclepiasterol在短期內(nèi)影響P-gp ATPase酶的活性，抑制其催化ATP水解的作用。
　　7. Asclepiasterol影響原癌基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim-1在模式耐藥細胞中的表達水平，通過基因沉默技術以及相關蛋白抑制劑干擾Pim-1在模式耐藥腫瘤細胞中的表達后發(fā)現(xiàn)P-gp的表達水平也明顯受到抑制。<

13、br>　　8. Asclepiasterol抑制P-gp與Pim-1的結(jié)合能力，從而影響了Pim-1增強P-gp在細胞膜上穩(wěn)定性的能力。
　　9.細胞信號通路MAPK/ERK在模式耐藥細胞中處于活化狀態(tài)，Asclepiasterol能夠顯著性地抑制該細胞信號通路的活性；MAPK/ERK通路抑制劑U0126-EtOH能夠抑制該通路關鍵蛋白P-ERK，并且介導下調(diào)P-gp在模式耐藥腫瘤細胞中的表達水平；MAPK/ERK通路激動劑表皮生

14、長因子EGF可以逆轉(zhuǎn)Asclepiasterol介導抑制P-ERK及P-gp表達的作用。
　　10. Asclepiasterol激活了P-gp在模式耐藥腫瘤細胞中泛素-蛋白酶體化蛋白降解通路，從而導致P-gp在耐藥細胞中表達水平的減少；泛素-蛋白酶體化通路抑制劑MG-132能夠顯著性地抑制Asclepiasterol所介導的增強P-gp泛素化降解的作用。
　　研究結(jié)論：
　　1.Asclepiasterol能夠有效逆

15、轉(zhuǎn)P-gp介導的腫瘤多藥耐藥；
　　2.Asclepiasterol通過短期抑制P-gp外排功能和長期抑制P-gp蛋白表達兩方面的作用發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)P-gp介導腫瘤多藥耐藥的作用；
　　3.Asclepiasterol通過原癌基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim-1、絲裂原活化蛋白激酶細胞信號通路MAPK/ERK以及泛素-蛋白酶體蛋白降解系統(tǒng)參與調(diào)控P-gp在模式耐藥腫瘤細胞中的功能與表達水平。
　　3.Asclepiast