口腔鱗癌細胞中miRNA-222與CDKN1B(p27kip1)mRNA及靶蛋白表達關系的研究.pdf

1、目的：口腔鱗癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占頜面部惡性腫瘤的80％以上，在全身范圍的惡性腫瘤中居第八位[1]。近年來，口腔鱗癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前臨床上對口腔鱗癌的治療方法以手術擴大切除為主，輔以放療、化療、生物治療、靶向治療、免疫治療等。雖然對于口腔鱗癌的治療手段實現(xiàn)多元化及精準化，但因其易發(fā)生局部復發(fā)及淋巴轉移和遠端轉移而影響口腔鱗癌患者的預后。

2、因此深入了解口腔鱗癌的發(fā)病機制、早期診斷及預后分析顯得十分迫切。研究證實多種原癌基因及抑癌基因的異常表達可能與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。miRNA是一類內源性非編碼小RNA，長約18～23 nt。miRNA因其非編碼特性可在翻譯水平或者轉錄后水平調控一個或多個靶基因 mRNA及靶蛋白的表達水平［2］。CDKN1B（p27kip1）是近來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，其是細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白CDKI家族的最新成員，其與細胞周期關系密

3、切，可以阻斷細胞從G1期到S期。本研究通過對人舌鱗癌細胞株TCA-83瞬時轉染miRNA-222模擬物及抑制物，同時設立陰性對照，分析其靶基因 CDKN1B（p27kip1） mRNA差異性表達及其靶蛋白在口腔鱗癌細胞中的表達差異，探討miRNA-222對口腔鱗癌細胞中 CDKN1B（p27kip1）的靶向調控作用，以期對口腔鱗癌的早期發(fā)現(xiàn)、準確診斷、靶向治療等提供一定的理論基礎。
　　方法：
　　1通過 Lipofecta

4、mineTM2000轉染試劑將人工合成的 miRNA-222 mimics（miRNA-222上調組）和 inhibitor（miRNA-222下調組）轉染人舌鱗癌細胞株TCA-83，同時設立陰性對照組及空白對照組。應用反轉錄-聚合酶鏈式擴增技術（RT-PCR）分別檢測miRNA-222模擬物及抑制物轉染組及陰性對照組、空白對照組中 CDKN1B（p27kip1）基因 mRNA的表達量，流式細胞術檢測各組細胞中靶基因蛋白CDKN1B（p

5、27kip1）的表達情況。
　　2統(tǒng)計學方法：應用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，均經(jīng)正態(tài)檢驗符合正態(tài)分布（P＞0.05），采用單因素方差分析（one-factor ANOVA）進行組間兩兩比較， P＜0.05，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1 RT-PCR檢測CDKN1B（p27kip1）mRNA的表達量
　　空白對照組（0.35±0.02）與mi

6、RNA-222 mimics轉染組（0.31±0.04）及 miRNA-222 inhibitor（0.40±0.01）轉染組相比較，P=0.031＜0.05， P=0.015＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；陰性對照組（0.35±0.03）與miRNA-222 mimics轉染組及miRNA-222 inhibitor轉染組相比較，P=0.037＜0.05，P=0.012＜0.05，miRNA-222 mimics轉染組與miRNA-22

7、2 inhibitor轉染組相比較，P=0.037＜0.05，差異均有統(tǒng)計學意義；空白對照組與陰性對照組相比較，P=0.928＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　2流式細胞術檢測CDKN1B（p27kip1）蛋白表達量
　　miRNA-222空白對照組其相應門 X-mode值為8.0， FI=lg8.0×340=307.05；miRNA-222 mimics轉染組其相應門X-mode值為5.4，F(xiàn)I=lg5.4×340=24

8、9.01；miRNA-222 inhibitor轉染組其相應門X-mode值為13.4， FI=lg13.4×340=383.21。miRNA-222過表達時其CDKN1B（p27kip1）蛋白含量降低，反之，miRNA-222抑制后其p27kip1蛋白含量升高。
　　3人舌鱗癌細胞株TCA-83中miRNA-222對CDKN1B（p27kip1）的調控作用
　　miRNA-222過表達時其CDKN1B（p27kip1）mR

9、NA表達量為0.31±0.04，蛋白表達量FI=249.01，CDKN1B（p27kip1）mRNA及蛋白表達量較空白對照組及陰性對照組均降低，反之，miRNA-222抑制后其CDKN1B（p27kip1）mRNA（0.40±0.01）及蛋白表達量（FI=383.21）均較空白對照組及陰性對照組升高。
　　結論：
　　1脂質體介導轉染miRNA-222 mimics后可使人舌鱗癌細胞株TCA-83中miR-222過表達，反之