miR-140-5p調(diào)控TGF-β和IGF-1信號通路影響腎母細(xì)胞瘤增殖和侵襲的分子機(jī)制研究.pdf

1、腎母細(xì)胞瘤(Nephroblastoma)，又稱Wilm's瘤，起源于胚胎性組織，是兒童最常見的腹部惡性腫瘤之一，多發(fā)生于5歲以下兒童，中國的發(fā)病率約為3.3每百萬人，其發(fā)病率約占兒童惡性腫瘤的8-10％和兒童腎臟腫瘤95％。近年來，由于綜合治療措施的進(jìn)步，使得疾病的生存率有了很大提高，目前國際上總生存率可達(dá)到70％至80％，甚至更高。但在疾病的末期仍有惡性轉(zhuǎn)移的可能性，目前該病仍有5％的死亡率。因此，發(fā)現(xiàn)腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，

2、對找到干預(yù)腫瘤發(fā)生，發(fā)展的方法和提高腫瘤的治愈率有重要意義。microRNAs（miRNAs）是一類長約17-24個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，是一種基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。miRNAs與腫瘤密切相關(guān)，但是特異性miRNAs如何通過靶基因調(diào)控腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程的詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)行深入研究。本研究通過miRNAs芯片技術(shù)和生物信息學(xué)等方法篩選腎母細(xì)胞瘤組織中差異表

3、達(dá)的關(guān)鍵miRNAs，選定miR-140-5p為研究對象，尋找并驗(yàn)證miR-140-5p的靶基因TGFBR1和IGF1R并進(jìn)行功能驗(yàn)證。進(jìn)一步研究了miR-140-5p通過調(diào)控靶基因TGFBR1和IGF1R所在的信號通路TGF-β和IGF-1來影響腎母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲的分子機(jī)制。
　　目的：
　　證實(shí)miR-140-5p抑制腎母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲;明確miR-140-5p通過調(diào)控TGF-β和IGF-1信號通路影響腎母細(xì)胞瘤

4、增殖和侵襲。
　　方法：
　　1.采用miRNA表達(dá)譜芯片檢測腎母細(xì)胞瘤組織和瘤旁非腫瘤腎組織中的miRNA表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNAs。
　　2.通過對芯片結(jié)果的生物信息學(xué)分析和莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證，最終篩選出miR-140-5p為研究對象。
　　3.慢病毒感染的方法建立穩(wěn)定表達(dá)miR-140-5p的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p; MTS法檢測不

5、同處理組細(xì)胞的增殖率;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;遷移實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞株侵襲能力。
　　4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-140-5p對其關(guān)鍵靶基因的調(diào)控位點(diǎn);同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告基因方法驗(yàn)證miR-140-5p對其關(guān)鍵靶基因TGFBR1和IGF1R3'UTR區(qū)的調(diào)控作用。
　　5.ELISA方法檢測細(xì)胞上清中FGF9含量，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測靶基因TGFBR1和IGF1R的表達(dá)情況，同時(shí)檢測兩者所在的信號通路TGF-β通路的下游蛋白Smad

6、2/3，F(xiàn)GF9，ERK和AKT與IGF-1通路的下游蛋白AKT的表達(dá)情況。
　　6.回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-140-5p對TGFBR1和IGF1R的特異性抑制作用。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:SPSS13.0錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。*p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.miRNA表達(dá)譜芯片檢測腎母細(xì)胞瘤組織和瘤旁非腫瘤腎組織中的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)大量

7、差異表達(dá)miRNAs。生物信息學(xué)分析選擇miR-140-5p為關(guān)鍵miRNAs。Q-PCR方法擴(kuò)大樣本驗(yàn)證miR-140-5p在腎母細(xì)胞瘤組織中呈低表達(dá)狀態(tài)。
　　2.慢病毒感染的方法建立穩(wěn)定表達(dá)miR-140-5p的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p。miRNA無關(guān)序列(miRNA-NC)作為對照組，與對照組相比，過表達(dá)G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p

8、組增殖率出現(xiàn)明顯降低(p＜0.05);細(xì)胞周期組織在G0/G1期。遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p組細(xì)胞覆蓋率比miRNA-NC組明顯降低。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明miR-140-5p能夠?qū)GFBR1和IGF1R基因的3'UTR起抑制性調(diào)控作用;基因沉默實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-140-5p能夠抑制TGFBR1和IGF1R蛋白的表達(dá)。
　　4.與miRNA

9、-NC組相比，免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G401miR-i40-5p和WT-CLS1miR-140-5p組TGFBR1和IGF1R蛋白的表達(dá)出現(xiàn)下降。同時(shí)TGFBR1下游蛋白Samd2/3，P-ERK和P-AKT蛋白也出現(xiàn)表達(dá)降低;IGF1R及其下游蛋白P-AKT蛋白也出現(xiàn)表達(dá)下降。
　　5.在G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p細(xì)胞中分別回復(fù)TGFBR1和IGF1R表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TGFBR1及其下游蛋白Samd2/