陽春砂AvTPS1原核表達(dá)及在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的:
　　單萜化合物作為植物次級代謝產(chǎn)物萜類化合物中分子量最小，分布最廣的一類，有著廣泛的藥理作用。砂仁是化濕類中藥，陽春砂Amomum villosum Lour.是砂仁的主要來源植物。陽春砂中發(fā)揮行氣化濕藥理作用的主要成分是揮發(fā)油，揮發(fā)油含有較豐富的單萜化合物，其中代表性的單萜化合物有乙酸龍腦酯、龍腦和樟腦等。
　　盡管植物萜類化合物生物合成途徑的上游途徑已經(jīng)比較清楚，但其萜類化合物合成的下游途徑，即從萜類化合物前體到

2、具體的萜類化合物的合成途徑仍不清楚。本課題對陽春砂果實發(fā)育不同時期的轉(zhuǎn)錄組和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入挖掘，篩選到若干個與陽春砂單萜下游合成途徑相關(guān)的單萜合酶候選基因，其中AvTPS1可能參與從香葉基焦磷酸到龍腦、乙酸龍腦酯和樟腦等單萜化合物的合成。因此，在克隆AvTPS1的基礎(chǔ)上，構(gòu)建AvTPS1的原核表達(dá)載體，進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，以及構(gòu)建真核表達(dá)載體，在煙草中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，為該基因在原核和真核系統(tǒng)中進(jìn)行功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

3、r>　　方法:
　　1.通過In-Fusion和Gateway方法構(gòu)建重組表達(dá)載體
　　以重組克隆載體pLB-AvTPS1質(zhì)粒為模板，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計特定的In-Fusion引物和Gateway引物，分別擴(kuò)增獲得相應(yīng)的目的基因片段。用In-Fusion方法，將帶6×HIS標(biāo)簽的表達(dá)載體pET-32a(+)經(jīng)過NcoⅠ線性化處理后，與AvTPS1截除質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的片段進(jìn)行無縫連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pE

4、T-32a(+)-(-tp)AvTPS1。同樣地，pBI121載體由XbaⅠ、SacⅠ雙酶切線性化處理后，與完整編碼區(qū)片段用In-Fusion酶進(jìn)行連接，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pBI-AvTPS1。用Gateway方法將擴(kuò)增獲得的AvTPS1完整閱讀框片段連接到入門克隆載體pENTR中，然后通過LR交換反應(yīng)連接到含有6×HIS標(biāo)簽的pDEST17上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pDEST17-AvTPS1。通過測序與已有的序列進(jìn)行比對，驗證載體構(gòu)建的

5、正確性。
　　2.AvTPS1原核表達(dá)
　　用熱擊法將構(gòu)建成功的pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和pDEST17-AvTPS1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)、BL21-CodonPlus、BL21DE3(Rosetta)和BL21(DE3)pLyS，用菌液PCR篩選陽性重組子。對含有表達(dá)載體pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1的重組BL21(DE3)和BL21-CodonPlus，以0.5mM IPTG，

6、在37℃下誘導(dǎo)2h后，離心收集菌體;對含有表達(dá)載體pDEST17-AvTPS1的重組大腸桿菌工程菌BL21(DE3)pLyS，用1mMIPTG誘導(dǎo)，37℃下振蕩培養(yǎng)4h，離心收集菌體。用超聲法破碎細(xì)胞，獲取蛋白，接著用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。對各自含有兩個表達(dá)載體的工程菌BL21DE3(Rosetta)，用0.5mM IPTG誘導(dǎo)，37℃下振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，6h收集的菌體，同樣方法獲得蛋白后，進(jìn)行Western雜交檢測，用HIS的一抗孵育

7、過夜，再與紅外熒光染料標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育，洗膜后進(jìn)行紅外熒光顯影檢測雜交結(jié)果。
　　3.AvTPS1基因在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化
　　用凍融法將構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，用菌液PCR法篩選陽性重組子。本論文使用了課題組前期獲得的AvDXR（MEP途徑上游關(guān)鍵酶基因）轉(zhuǎn)基因煙草（標(biāo)記為D）、AvDXR和AvHMGR（MVA途徑上游關(guān)鍵酶基因）共轉(zhuǎn)化煙草（標(biāo)記為DH）及對應(yīng)的野生型煙草（標(biāo)記為C），

8、用于遺傳轉(zhuǎn)化。用種子培養(yǎng)上述煙草的無菌苗，以無菌苗葉片為外植體，用農(nóng)桿菌葉盤法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化:煙草葉盤先用MS1培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3d，然后用活化好的重組農(nóng)桿菌侵染15 min，轉(zhuǎn)移到MS2培養(yǎng)基進(jìn)行黑暗共培養(yǎng)2d，再轉(zhuǎn)移到MS3培養(yǎng)基光照培養(yǎng)，至外植體分化出芽并長出4-6片葉后，轉(zhuǎn)移至MS4培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，期間每20 d繼代一次。用植物基因組DNA試劑盒提取煙草葉片的基因組DNA，PCR檢測目的基因AvTPS1、AvDXR和AvHMGR，

9、篩選轉(zhuǎn)基因煙草。
　　結(jié)果:
　　1.載體構(gòu)建
　　PCR檢測篩選到pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1、pDEST17-AvTPS1和pBI-AvTPS1的陽性重組子。測序結(jié)果表明，pDEST17-AvTPS1與pBI-AvTPS1的插入片段的編碼區(qū)與pLB-AvTPS1中目的基因的編碼區(qū)完全一致，pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1與截掉信號肽后的序列完全一致。成功構(gòu)建了陽春砂AvTPS1帶有截除質(zhì)

10、體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的原核表達(dá)載體pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和含完整編碼區(qū)序列的原核表達(dá)載體pDEST17-AvTPS1，以及用于煙草遺傳轉(zhuǎn)化的真核表達(dá)載體pBI-AvTPS1。
　　2.原核表達(dá)
　　經(jīng)過PCR檢測，重組表達(dá)載體pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1、pDEST17-AvTPS1成功轉(zhuǎn)入不同的大腸桿菌菌株中（見前文方法2）。經(jīng)過SDS-PAGE檢測顯示:pET-32a(+)-(-tp)AvT

11、PS1在大腸桿菌BL21DE3和BL21-CodonPlus，以及pDEST17-AvTPS1在BL21(DE3)pLyS中表達(dá)均沒有觀察到肉眼可見明顯的條帶。但是Western雜交檢測顯示:pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1、pDEST17-AvTPS1在大腸桿菌BL21DE3(Rosetta)中大量表達(dá)后有呈現(xiàn)相應(yīng)目的蛋白大小的條帶，且截掉質(zhì)體信號肽的蛋白比完整編碼區(qū)蛋白分子量小。
　　3.AvTPS1轉(zhuǎn)基因煙草的獲

12、得
　　通過菌液PCR和質(zhì)粒PCR檢測，構(gòu)建成功含有重組表達(dá)載體的工程農(nóng)桿菌 EHA105(pBI-AvTPS1/EHA105)。農(nóng)桿菌浸染法獲得約55株轉(zhuǎn)化煙草苗，其中pBI-AvTPS1轉(zhuǎn)化D株系的轉(zhuǎn)化苗約有25株，pBI-AvTPS1轉(zhuǎn)化DH株系的轉(zhuǎn)化苗約有30株。挑選22株成長情況較好的轉(zhuǎn)基因煙草，提取基因組DNA，經(jīng)PCR檢測，最終篩選得到11株含有AvTPS1的轉(zhuǎn)基因煙草，其中AvTPS1和AvDXR雙基因共轉(zhuǎn)化的煙草

13、5株，AvTPS1和AvDXR、AvHMGR三個基因共轉(zhuǎn)化的煙草3株，以及3株只含有AvTPS1的轉(zhuǎn)基因煙草。
　　結(jié)論:本文構(gòu)建了陽春砂AvTPS1的2個原核表達(dá)載體pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和pDEST17-AvTPS1，這兩個表達(dá)載體在BL21DE3(Rosetta)中誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)Western雜交檢測到相應(yīng)蛋白，為后續(xù)優(yōu)化表達(dá)條件，獲得純化蛋白進(jìn)行功能鑒定提供了基礎(chǔ)。構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體pBI-AvTP