鳶尾素的定位機(jī)制及其功能研究.pdf

1、鳶尾素(irisin)是Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白5(FNDC5)的翻譯后加工產(chǎn)物，可以結(jié)合白色脂肪細(xì)胞的未知受體，促進(jìn)白色脂肪棕色化。目前關(guān)于irisin亞細(xì)胞定位機(jī)制的研究處于起步階段，且其促進(jìn)白色脂肪棕色化的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本研究通過檢測FNDC5信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的定位功能，了解其對irisin亞細(xì)胞定位的影響;針對FNDC5的剪切和N-連接糖基化修飾進(jìn)行研究，揭示irisin的亞細(xì)胞定位機(jī)制;利用原核表達(dá)的GST-ir

2、isin處理小鼠白色脂肪細(xì)胞，探索irisin促進(jìn)白色脂肪棕色化的作用機(jī)制。
　　(1)FNDC5信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域定位功能的檢測
　　為檢測FNDC5信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的定位功能，了解信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)risin定位的影響，本研究使用Phobius程序分析FNDC5信號肽，使用SignalP4.1 Server程序分析FNDC5的跨膜結(jié)構(gòu)域。根據(jù)分析結(jié)果，分別構(gòu)建信號肽表達(dá)載體pEGFP-SP、跨膜結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體pEG

3、FP-TM和FNDC5表達(dá)載體pFNDC5-EYFP，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明:EGFP-SP定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，EGFP-TM定位于細(xì)胞膜，F(xiàn)NDC5-EYFP在細(xì)胞膜發(fā)出黃色熒光。以上結(jié)果表明FNDC5信號肽具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位功能，跨膜結(jié)構(gòu)域能夠?qū)risin定位于細(xì)胞膜。
　　(2)FNDC5剪切作用及irisin分泌過程的研究
　　為探索FNDC5可能存在的蛋白質(zhì)剪切作用，檢測irisin

4、如何分泌到細(xì)胞外，本研究構(gòu)建pEGFP-FNDC5和pDsred2-FNDC5-EGFP表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，分別觀察融合蛋白及其剪切產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。使用GFP抗體對EGFP-FNDC5、FNDC5-EYFP和Dsred2-FNDC5-EGFP蛋白及其剪切產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting檢測，觀察融合蛋白剪切產(chǎn)物的相對分子量。結(jié)果表明:FNDC5在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域處發(fā)生兩次剪切。切除信號肽的FNDC5在跨膜結(jié)構(gòu)域的作用

5、下定位于細(xì)胞膜，隨后經(jīng)過跨膜結(jié)構(gòu)域處的剪切，irisin被分泌到細(xì)胞外。因此FNDC5的剪切是鳶尾素分泌的前提。
　　(3)FNDC5蛋白N-連接糖基化修飾的檢測
　　為了驗(yàn)證FNDC5的N-連接糖基化修飾，本研究使用糖苷酶PNGase F和糖苷酶Endo H分別酶切肌肉組織總蛋白，使用irisin單克隆抗體對經(jīng)糖苷酶酶切的肌肉組織總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測。結(jié)果表明:FNDC5蛋白存在PNGase F和

6、Endo H敏感的N-連接糖基化修飾，因此FNDC5是N-連接糖基化修飾糖蛋白。
　　(4)FNDC5的N-連接糖基化修飾對irisin分泌影響的研究
　　為探索FNDC5的N-連接糖基化修飾與irisin分泌的關(guān)系，本研究使用NetNGlyc1.0 Server程序分析FNDC5的N-連接糖基化修飾位點(diǎn)。根據(jù)分析結(jié)果，構(gòu)建FNDC5的N-連接糖基化修飾位點(diǎn)點(diǎn)突變載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位。使用GFP抗體

7、分別對糖基化修飾位點(diǎn)點(diǎn)突變的融合蛋白進(jìn)行Western blotting檢測。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明:第36位氨基酸突變的FNDC5融合蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留，第81位氨基酸突變的FNDC5融合蛋白的亞細(xì)胞定位與野生型FNDC5融合蛋白相同。Western blotting檢測結(jié)果表明:與野生型的FNDC5融合蛋白相比，第36或81位氨基酸突變的FNDC5融合蛋白的相對分子量均減小。經(jīng)糖苷酶PNGase F酶切，野生型的FNDC5融合蛋白和第36

8、或81位氨基酸突變的FNDC5融合蛋白的相對分子量均降至51kDa。因此FNDC5第36和81位氨基酸均為FNDC5蛋白N-連接糖基化修飾位點(diǎn)。FNDC5第36位氨基酸的N-連接糖基化修飾是FNDC5信號肽剪切及irisin分泌的重要保障。
　　(5)白色脂肪細(xì)胞的分離和鑒定
　　為研究irisin對白色脂肪細(xì)胞棕色化作用機(jī)制做初步的細(xì)胞準(zhǔn)備，本研究采用膠原酶消化法，從C57BL/6小鼠腹股溝的白色脂肪組織分離白色脂肪細(xì)胞，

9、肩胛間的棕色脂肪組織分離棕色脂肪細(xì)胞。以棕色脂肪細(xì)胞為對照，使用細(xì)胞免疫熒光、熒光定量PCR和Western blotting對白色脂肪細(xì)胞進(jìn)行鑒定。細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示白色和棕色脂肪細(xì)胞均呈解偶聯(lián)蛋白1(UCP-1)陽性，白色脂肪細(xì)胞呈溶質(zhì)載體家族7成員10(ASC-1)陽性，棕色脂肪細(xì)胞呈ASC-1陰性。熒光定量PCR結(jié)果表明:白色脂肪細(xì)胞中UCP-1表達(dá)量為棕色脂肪細(xì)胞的0.47倍(P＜0.05)，α-tubulin的表達(dá)量為

10、棕色脂肪細(xì)胞的1.41倍(P＞0.05)。Westernblotting檢測結(jié)果顯示:白色脂肪細(xì)胞中UCP-1表達(dá)量是棕色脂肪細(xì)胞0.49倍(P＜0.01),α-tubulin表達(dá)量是棕色脂肪細(xì)胞1.53倍(P＞0.05)，棕色脂肪細(xì)胞中未檢測到ASC-1的表達(dá)。因此所分離的細(xì)胞為白色脂肪細(xì)胞，可以用于后續(xù)irisin對白色脂肪細(xì)胞影響的研究。
　　(6)小鼠FNDC5組織表達(dá)譜的檢測
　　為了解FNDC5的組織表達(dá)，為FN

11、DC5基因的克隆奠定基礎(chǔ)，本研究通過熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測小鼠心臟、肌肉、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、白色脂肪和棕色脂肪組織中FNDC5表達(dá)。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:FNDC5在心臟表達(dá)量極顯著高于肌肉、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、白色脂肪和棕色脂肪組織（均P＜0.01）。Western blotting檢測結(jié)果表明:FNDC5在心臟和肌肉組織總蛋白樣品中出現(xiàn)特異性條帶。因此FNDC5在心臟和肌肉組織中高表

12、達(dá)。
　　(7)FNDC5和irisin的原核表達(dá)
　　為純化FNDC5和irisin蛋白，本研究以心臟組織cDNA為模板，擴(kuò)增FNDC5和irisin基因。將FNDC5和irisin基因與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽以C端融合的方式重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-FNDC5和PGEX-4T-1-irisin，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS中，經(jīng)1.0mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)37℃誘導(dǎo)表達(dá)

13、后，使用谷胱甘肽瓊脂糖珠純化GST-FNDC5和GST-irisin融合蛋白，并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和Western blotting檢測。結(jié)果表明:IPTG可誘導(dǎo)GST-FNDC5和GST-irisin蛋白的表達(dá)，本研究所使用的irisin抗體能夠與FNDC5和irisin發(fā)生特異結(jié)合。
　　(8)Irisin促進(jìn)白色脂肪棕色化作用機(jī)制的初步探討
　　為了解irisin促進(jìn)白色脂肪棕色化的作用機(jī)制，本研究使用原核表達(dá)的GST

14、-irisin(10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL)處理白色脂肪細(xì)胞6h后，利用熒光定量PCR檢測UCP-1的表達(dá)量。結(jié)果表明:與對照組0ng/mL相比，三個(gè)處理組UCP-1的表達(dá)量均有升高，10ng/mL處理組與100ng/mL處理組和1μg/mL處理組UCP-1的表達(dá)量均有極顯著差異(P＜0.01)。100ng/mL處理組與1μg/mL處理組UCP-1的表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)。因此GST-irisin最佳使用濃