天麻素的神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　天麻為蘭科屬植物，其塊莖可以入藥。中醫(yī)認(rèn)為，天麻性味甘、平，入肝經(jīng)。具有息風(fēng)、定驚的功效，可用于治療眩暈眼黑，頭風(fēng)頭痛，肢體麻木，半身不遂，語(yǔ)言蹇澀，小兒驚癇動(dòng)風(fēng)。近來(lái)的藥理學(xué)研究顯示，天麻具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、止痛、益智和抗炎作用，還可以改善循環(huán)，可以用于治療多種心血管疾病，包括偏頭痛、癲癇和抑郁癥。作為其主要藥學(xué)成分，天麻素已被發(fā)現(xiàn)可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞抑制誘導(dǎo)型一

2、氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2）和促炎性細(xì)胞因子細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào)作用，我們的已往研究也發(fā)現(xiàn)天麻素可以改善增強(qiáng)單次延長(zhǎng)應(yīng)激（enhanced single prolonged stress，ESPS）所致大鼠的焦慮樣行為，而且這一作用與其降低海馬IL-6、IL-1β水平，抑制iNOS表達(dá)和 p38 MAPK磷酸化水平有關(guān)。此外，最近的

3、研究表明，天麻素也具有抗氧化作用[16]，其可以通過(guò)激活ERK2/1-Nrf2通路，上調(diào)過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶的活性（SOD），抑制原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元對(duì)β-淀粉樣肽誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。因此，天麻素也可能通過(guò)抑制炎癥相關(guān)通路上調(diào)機(jī)體的抗氧化水平從而維持大腦結(jié)構(gòu)和功能的完整性以發(fā)揮其抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)作用。
　　【目的】
　　1．觀察天麻素對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)應(yīng)激（CUS）大鼠抑郁樣行為的改善作用及對(duì)海馬和海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞

4、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)的影響。
　　2．觀察天麻素的抗炎效應(yīng)以及其對(duì)抑郁樣行為和海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。
　　3．觀察天麻素對(duì)腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究。
　　【方法】
　　1．構(gòu)建抑郁大鼠模型，給予不同劑量的天麻素干預(yù)，持續(xù)2周。隨后，通過(guò)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠的抑郁樣行為，在行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，處死大鼠，通過(guò)免疫組化和Western blot檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（G

5、FAP）和BDNF的表達(dá)情況。通過(guò)原代培養(yǎng)獲得海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，給予不同劑量天麻素（sham、5、10、20、50和100μg/mL)48或72小時(shí)后，觀察天麻素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力、ERK磷酸化和BDNF水平的作用，并通過(guò)去血清培養(yǎng)，觀察不同劑量天麻素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　2．大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)10天：自由攝食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫恒濕，通過(guò)燈光調(diào)節(jié)晝夜轉(zhuǎn)換循環(huán)（12：12小時(shí)）。隨后，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（sham），對(duì)照+

6、低劑量天麻素組（50 mg/kg）、對(duì)照+中劑量天麻素組（100 mg/kg）、對(duì)照+高劑量組天麻素組（200 mg/kg）以及模型組（CUS），模型+天麻素低、中、高劑量組（50、100或者200 mg/kg），每組12只。對(duì)照組以及對(duì)照+不同劑量天麻素組不進(jìn)行CUS造模，但是每天腹腔注射生理鹽水或者不同劑量天麻素，連續(xù)14天；模型組以及模型+不同劑量天麻素組進(jìn)行C US造模，并且在造模結(jié)束后，每天腹腔注射生理鹽水或不同劑量的天麻素（

7、50、100或者200 mg/kg），持續(xù)14天。各處理腹腔注射生理鹽水或者天麻素的時(shí)間均為上午9:00至10:00。隨后，每組大鼠中的一部分（n=8）進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，在行為學(xué)測(cè)試后處死大鼠，通過(guò)免疫組化和Western blot、Elisa檢測(cè)大鼠海馬細(xì)胞增殖情況，蛋白表達(dá)和IL-1β釋放水平。其余部分大鼠（n=4）用于Morris水迷宮測(cè)試。在造模每周末以及天麻素干預(yù)結(jié)束后測(cè)量體重。離體實(shí)驗(yàn)：對(duì)離體培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞添加不

8、同劑量的天麻素（0、5、10、20、50μg/mL)，作用3天或5天后，觀察細(xì)胞活力。此外，在細(xì)胞克隆球的細(xì)胞培養(yǎng)體系加入終濃度為10 ng/ml的IL-1β，作用2小時(shí)后再加入不同劑量的天麻素，作用24或48小時(shí)后，通過(guò)BrdU染色和細(xì)胞活力測(cè)試觀察天麻素的保護(hù)作用。
　　3．小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)10天后，機(jī)分為以下5組：對(duì)照組（sham），模型組（MCAO+Vehicle），模型+天麻素低、中、高劑量組，即MCAO+GAS（L）、M

9、CAO+GAS（M）和MCAO+ GAS（H）。對(duì)照組和模型組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中腹腔注射生理鹽水，MCAO+GAS（L）、MCAO+GAS（M）和 MCAO+GAS（H）則分別注射10、50和100 mg/kg體質(zhì)量的生理鹽水，注射液體量為0.1ml/kg體質(zhì)量。
　?。?）為了觀察天麻素對(duì)MCAO損傷的保護(hù)作用，sham組行假手術(shù)：水合氯醛麻醉后，取右頸部切口，逐層分離肌肉暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。1小時(shí)后腹腔注射生理鹽水，縫合創(chuàng)口。MCAO

10、+Vehicle組經(jīng)MCAO干預(yù)1小時(shí)后，腹腔注射生理鹽水，拔出線栓，縫合創(chuàng)口。MCAO+GAS（L）、MCAO+GAS（M）和MCAO+GAS（H）與MCAO組干預(yù)方式相似，但是注射了不同劑量的天麻素。在缺血24小時(shí)后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，隨后處死動(dòng)物，取部分小鼠的缺血側(cè)半腦進(jìn)行Western Blot或MDA和SOD檢測(cè)，其余小鼠灌注固定后，取大腦冰凍切片，進(jìn)行Nissl染色。
　?。?）為了觀察天麻素在MCAO延遲期的作用，sh

11、am組假手術(shù)1小時(shí)后，腹腔注射生理鹽水，縫合創(chuàng)口，并在隨后的6天，同一時(shí)間點(diǎn)注射等劑量的生理鹽水。MCAO+ Vehicle組的干預(yù)方式與sham組相似，但是經(jīng)MCAO造成缺血再灌注。MCAO+GAS（L）、MCAO+GAS（M）和MCAO+GAS（H）與MCAO組干預(yù)方式相似，但是注射了不同劑量的天麻素。在最后一次注射生理鹽水或天麻素24小時(shí)后，對(duì)各處理組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，隨后處死動(dòng)物，取部分小鼠的缺血側(cè)半腦進(jìn)行Western B

12、lot或MDA和SOD檢測(cè)，其余小鼠灌注固定后，取大腦冰凍切片，進(jìn)行Nissl染色。
　　（3）為了觀察天麻素對(duì)MCAO急性期所致氧化應(yīng)激和炎癥水平的抑制作用，5組小鼠造模和給藥方式同3.1，但不同的是在缺血6小時(shí)后再進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　【結(jié)果】
　　（1）慢性不可預(yù)見(jiàn)應(yīng)激（CUS）可以導(dǎo)致明顯的抑郁樣行為，包括糖水偏好減少和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，CUS還顯著抑制了海馬GFAP和BDNF的表達(dá)水平。而一定劑量（1

13、00和200 mg/Kg）天麻素慢性干預(yù)可以緩解上述情況。此外，天麻素直接干預(yù)并不影響海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活力，但是20μg/ml劑量條件下對(duì)去血清損傷有一定的保護(hù)作用，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。
　?。?）天麻素緩解CUS所致大鼠體重減輕，但是對(duì)運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有顯著作用。天麻素緩解CUS所致大鼠抑郁樣行為和空間記憶損傷，抑制了CUS所致大鼠血漿IL-1β和IL-6水平和海馬炎性通路的表達(dá)

14、水平上調(diào)，還可以上調(diào)海馬BDNF和GDNF的表達(dá)水平和海馬的增殖。此外，天麻素直接干預(yù)并不影響海馬神經(jīng)干細(xì)胞活力，但是10μg/ml和20μg/mll劑量條件下對(duì)IL-1β所致細(xì)胞活力損傷有一定的保護(hù)作用。
　?。?）天麻素干預(yù)（50和100 mg/Kg）減少了MCAO所致小鼠急性期及延遲期腦梗死容積，并且改善其神經(jīng)功能評(píng)分；緩解了MCAO所致小鼠大腦的形態(tài)學(xué)損傷并抑制了大腦的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，此外，上述劑量條件下的天麻素干預(yù)抑

15、制了MCAO所致小鼠急性期大腦氧化應(yīng)激水平，并且抑制了促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況。
　　【結(jié)論】
　　1．一定劑量的天麻素對(duì)CUS所致抑郁樣行為具有改善作用，這一作用可能與天麻素維持海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，上調(diào)ERK1/2磷酸化和BDNF的表達(dá)水平有關(guān)。
　　2．天麻素對(duì)抑郁樣行為的改善作用可能與其抑制促炎性細(xì)胞因子水平，抑制炎癥相關(guān)通路，改善海馬神經(jīng)發(fā)生和維持神經(jīng)干細(xì)胞活性有關(guān)。
　　3．天麻素通過(guò)其抗炎和抗氧化