低劑量三七素的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景：
　　三七屬五加科多年生草本植物，又稱(chēng)為田七，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材之一，被明代著名藥學(xué)家李時(shí)珍稱(chēng)為“金不換”。因其有降血壓、擴(kuò)血管、改善微循環(huán)、抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、活血化瘀等功效而被普遍用于治療心腦血管疾病及免疫力低下等多種疾病。三七素（dencichine）是三七中的主要止血活性成分，但人畜在長(zhǎng)期食用含三七素的豆科山黧豆屬植物后出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)及神經(jīng)元進(jìn)行性變性壞死，對(duì)上述現(xiàn)象的研究發(fā)現(xiàn)，三七素作為一種興奮

2、性氨基酸具有神經(jīng)毒作用。三七素的藥用價(jià)值及其神經(jīng)毒性作用的矛盾使其成為廣大科研工作者的研究熱點(diǎn)。三七素是一種興奮性氨基酸類(lèi)似物，其具有兩種分子結(jié)構(gòu)體，包括L-BOAA和D-BOAA，研究表明具有神經(jīng)毒性的主要是L-BOAA，通過(guò)作用于非NMDA受體產(chǎn)生其神經(jīng)毒性作用，但是D-BOAA卻不會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)。由于谷氨酸及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的生理及病理作用，是腦缺血缺氧損傷、癲癇、癡呆等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致腦損傷的重要發(fā)病機(jī)制，

3、但研究又發(fā)現(xiàn)低劑量谷氨酸預(yù)處理可增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)上述疾病的耐受力。那么小劑量三七素預(yù)處理是否也會(huì)像谷氨酸一樣產(chǎn)生一定的神經(jīng)保護(hù)作用呢？從這一角度出發(fā)我們擬對(duì)低劑量三七素預(yù)處理對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用進(jìn)行初步探索。選取具有神經(jīng)元特性的PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，研究三七素預(yù)處理對(duì)多種損傷因素導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷的影響，初步探討低劑量三七素對(duì)PC12細(xì)胞的作用及其可能機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一：不同濃度三七素對(duì)PC12細(xì)胞的影響
　　目的：研究不同

4、濃度的三七素對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。方法：用DMEM+10％FBS細(xì)胞培養(yǎng)液復(fù)蘇、傳代PC12細(xì)胞，在細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。接種48小時(shí)后每組細(xì)胞中加入不同終濃度的三七素，96小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察且用MTT法評(píng)估細(xì)胞活性。結(jié)果：三七素作用48小時(shí)后，與正常對(duì)照組相比，5mM三七素組PC12細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體回縮，突觸減少。其余各組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，數(shù)量無(wú)減少。MTT結(jié)果與鏡下觀察結(jié)果相一致且0.01mM組有細(xì)胞增殖

5、作用。結(jié)論：低劑量（<2.5mM）三七素對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用且有一定的促增殖作用；高劑量三七素對(duì)PC12細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　實(shí)驗(yàn)二：低劑量三七素預(yù)處理對(duì)不同損傷模型下PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
　　目的：研究低劑量三七素預(yù)處理對(duì)損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用和可能的作用機(jī)制。方法：建立谷氨酸損傷模型、慢性缺氧模型及過(guò)氧化氫損傷模型，細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后加入三七素（0.01mM）預(yù)處理96小時(shí)，然

6、后加谷氨酸損傷4小時(shí)，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力和Hoechst33342/PI雙重染色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的死亡變化。結(jié)果：MTT法顯示4小時(shí)的谷氨酸損傷能造成50％的細(xì)胞損傷，三七素預(yù)處理組PC12細(xì)胞損傷情況明顯減輕，Hoechst33342/PI雙重染色法也得到相似的趨勢(shì)。慢性缺氧損傷12小時(shí)可造成約30％細(xì)胞損傷，三七素預(yù)處理組細(xì)胞損傷大約10％。過(guò)氧化氫損傷細(xì)胞60％，三七素預(yù)處理組損傷細(xì)胞比率為50％，較單純損傷組稍低，但兩者差別不具

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三七素對(duì)過(guò)氧化氫引起的細(xì)胞損傷無(wú)明顯作用。結(jié)論：低劑量三七素預(yù)處理能夠減輕谷氨酸損傷及慢性缺氧損傷導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷及活力減低，提示三七素具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用，但其上述保護(hù)作用及對(duì)過(guò)氧化氫損傷PC12細(xì)胞無(wú)影響的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　實(shí)驗(yàn)三：低劑量三七素對(duì)谷氨酸損傷的PC12細(xì)胞的治療作用
　　目的：研究三七素對(duì)谷氨酸損傷的PC12細(xì)胞的影響。方法：用谷氨酸復(fù)制體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞損傷模型，采

8、用MTT法、Hoechst33342/PI雙重染色法分別研究高、低劑量三七素對(duì)谷氨酸所致的PC12細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果：谷氨酸刺激后，PC12細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低（P<0.05）、凋亡顯著增強(qiáng)（P<0.05）。給予高劑量三七素可加重谷氨酸引起的PC12增殖力降低（P<0.05）、凋亡增強(qiáng)（P<0.05）。但低劑量三七素干預(yù)后，細(xì)胞存活率較模型組顯著升高（P<0.05），凋亡較模型組明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：高劑量三七素可加重