酵母PLP合成酶Snz1的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理研究及家蠶自噬通路的研究.pdf

1、(Ⅰ)磷酸吡哆醛(PLP)是維生素B6的活性形式，作為多種酶系統(tǒng)的輔酶，在蛋白質(zhì)和糖類(lèi)的代謝中起著重要作用。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道的PLP的體內(nèi)合成途徑有兩種，即脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)依賴(lài)途徑，和DXP非依賴(lài)途徑。DXP依賴(lài)的合成途徑主要存在于大腸桿菌和少量真核生物中，由PDX家族編碼的蛋白質(zhì)(PdxA、B、C、F、H、J和GapA)完成，機(jī)理目前已經(jīng)研究得非常透徹，PLP的合成前體是赤鮮糖-4-磷酸和1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸。

2、DXP非依賴(lài)途徑主要存在于大部分真菌以及植物等真核生物中，參與該合成途徑的蛋白只有兩個(gè)：Pdx1和Pdx2，它們以復(fù)合物的形式行使功能。其中Pdx2亞基為谷氨酰胺酶，Pdx1則是PLP合成酶。體外生化實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)這一途徑合成的PLP來(lái)源于一個(gè)三碳糖和一個(gè)五碳糖，最近的研究發(fā)現(xiàn)三碳糖是3-磷酸甘油醛(G3P)或者磷酸二羥戊酮(DHAP)，另一個(gè)底物五碳糖則是5-磷酸核糖(R5P)或者5-磷酸核酮糖(RBP)，而不同于DXP依賴(lài)途徑的是，P

3、LP骨架上的亞胺基不是來(lái)源于谷氨酸，而是由谷氨酰胺經(jīng)水解的銨離子提供。
　　 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在提供外源氨基的反應(yīng)體系中，Pdx1可單獨(dú)催化PLP合成過(guò)程中的一系列反應(yīng)，包括五碳糖、三碳糖的異構(gòu)、亞胺中間體的生成、氨基加成反應(yīng)和吡哆環(huán)的形成。在Pdx1催化底物生成PLP的過(guò)程中，Pdx1與底物五碳糖之間會(huì)生成亞胺中間體，后來(lái)在枯草芽孢桿菌中得到驗(yàn)證，同時(shí)鑒定出是由Pdx1的Lys149與RBP形成的中間體。然而海棲熱袍菌Pdxl的結(jié)

4、構(gòu)顯示，RBP與Lys80（枯草芽孢桿菌Pdxl的Lys81），而非Lys149，形成shill堿。為了說(shuō)明這兩個(gè)保守賴(lài)氨酸的作用，作者突變了枯草芽孢桿菌的Lys81和Lys149，體外酶活實(shí)驗(yàn)顯示，K81A和K149A均喪失了PLP合成的活性，K80A同時(shí)還失去了將R5P異構(gòu)成RBP的能力，但是K149A的異構(gòu)活性反而更高。這些結(jié)果證實(shí)，這兩個(gè)賴(lài)氨酸均對(duì)Pdx1的PLP合成活性至關(guān)重要，同時(shí)鑒定出了R5P/RBP的異構(gòu)化位點(diǎn)是Lys8

5、1。然而對(duì)于三碳糖的結(jié)合位點(diǎn)、異構(gòu)位點(diǎn)以及PLP的加成位點(diǎn)仍然不清楚。
　　 酵母中被鑒定出來(lái)的Pdx1同源基因有三個(gè)，包括Snzl、Snz2和Snz3，他們均屬于SNZ家族。PDX2同源基因也有三個(gè)，分別為SNO1、SN02和SN03，隸屬于SNO基因家族。這兩個(gè)家族編碼的蛋白質(zhì)之間存在多種相互作用關(guān)系，其中SNZ2/SN02和SNZ3/SN03參與維生素B1的合成，而SNZ1/SN01則與維生素B6和PLP的合成息息相關(guān)。<

6、br>　　 我們解析了釀酒酵母中Pdxl同源蛋白Snzl(2.30 A)的結(jié)構(gòu)，及Snzl分別與產(chǎn)物PLP(2.20 A)和底物G3P(1.80 A)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并且通過(guò)體外酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。基于結(jié)構(gòu)分析和體外生化實(shí)驗(yàn)分析，我們鑒定出了三個(gè)重要的活性位點(diǎn)，分別是PLP合成位點(diǎn)、G3P結(jié)合位點(diǎn)和G3P中轉(zhuǎn)位點(diǎn)。同時(shí)，在所得結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們提出了Pdx1/Snzl可能的催化機(jī)制

7、，即R5P和DHAP分別在各自的位點(diǎn)發(fā)生異構(gòu)反應(yīng)，然后被轉(zhuǎn)移到PLP合成位點(diǎn)，并在那里與Pdx2提供的氨基共同生成PLP。
　　 (Ⅱ)細(xì)胞編程性死亡(PCD: Programmed Cell Death)是一種進(jìn)化上高度保守的可調(diào)控的細(xì)胞自殺機(jī)制，負(fù)責(zé)清除衰老、無(wú)用或者病變的細(xì)胞，從而維持有機(jī)體的正常生命活動(dòng)。細(xì)胞編程性死亡主要包括兩種形式，即凋亡(Apoptosis)和自噬(Autophagy)，也被分別稱(chēng)為Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞編

8、程性死亡。自噬作為Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡，其細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞漿中自噬體的出現(xiàn)、溶酶體的激活和自噬溶酶體的形成。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，以溶酶體降解的形式參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)，特別是絕大多數(shù)長(zhǎng)半衰期蛋白質(zhì)的降解。
　　 自噬體的形成依賴(lài)于兩個(gè)重要的泛素樣結(jié)合通路(ubiquitin-likeconjugation systems)，分別是Atg8-磷脂酰乙醇胺(PE：phosphatidylethanolamine)通路和Atg1

9、2-Atg5-Atg16通路。自噬的調(diào)控則依賴(lài)于一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及蛋白質(zhì)復(fù)合體，包括TOR（雷帕霉素受體）信號(hào)通路、PI3K-I(磷脂酰肌醇三磷酸激酶Ⅰ)/Akt通路以及PI3K-Ⅲ蛋白復(fù)合體。TOR通過(guò)激活下游的一系列調(diào)控因子，進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，起到抑制自噬發(fā)生的作用；PI3K-I/Akt通路的激活可以抑制TSC2的GTP酶活性，使其無(wú)法將Rheb-GTP轉(zhuǎn)化為Rheb-GDP，而Rheb-GDP是TOR的負(fù)調(diào)控因子，因

10、此PI3K-I/Akt通路通過(guò)激活TOR通路發(fā)揮抑制自噬的功能；而同屬于PI3K家族的PI3K-Ⅲ，與其膜受體及Atg6(哺乳動(dòng)物Beclinl)形成復(fù)合物，是自噬的正調(diào)節(jié)因子，尤其在自噬體形成的早期發(fā)揮了重要的作用。
　　 自噬參與調(diào)控了生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分化等過(guò)程，協(xié)助細(xì)胞對(duì)抗惡劣環(huán)境的脅迫，同時(shí)對(duì)防止某些疾病如腫瘤、肌病、神經(jīng)退行性疾病以及在抵御病原微生物的感染和延緩衰老等方面發(fā)揮了重要的作用。此外，自噬還與昆蟲(chóng)的變態(tài)

11、發(fā)育過(guò)程息息相關(guān)。昆蟲(chóng)從幼蟲(chóng)到蛹的變態(tài)發(fā)育過(guò)程涉及某些原有組織的消退，比如果蠅的唾液腺，家蠶的前胸腺和絲腺組織。絲腺是五齡家蠶體內(nèi)體積最大的組織，包括前部(ASG)、中部(MSG)和后部絲腺(PSG)三個(gè)部分。在蛹前期，由蛻皮激素激活的細(xì)胞編程性死亡機(jī)制促使了絲腺組織的退化和降解。有文獻(xiàn)報(bào)道，家蠶的ASG在5齡第一天開(kāi)始分化，第三天可以觀察到細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，5齡后期則出現(xiàn)了自噬和凋亡的特征，這些現(xiàn)象說(shuō)明自噬和凋亡同時(shí)參與了絲腺的分化和降

12、解過(guò)程，但是二者之間的關(guān)系尚不清楚。不僅僅是在ASG細(xì)胞中存在自噬，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院的曹陽(yáng)教授研究組通過(guò)組織切片和電鏡技術(shù)在MSG細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了自噬體和自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說(shuō)明自噬很可能在家蠶絲腺的分化與降解過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用，但是具體的分子機(jī)制還不清楚。因此我們通過(guò)生物信息學(xué)分析找到了家蠶中的自噬相關(guān)蛋白，希望能夠構(gòu)建出家蠶的自噬通路，為將來(lái)系統(tǒng)的研究這些蛋白奠定基礎(chǔ)。
　　 我們通過(guò)一系列生物信息學(xué)分析，利

13、用序列比對(duì)的方法在家蠶數(shù)據(jù)SilkDB中找到了20多個(gè)自噬相關(guān)基因，并且基于酵母和哺乳動(dòng)物的自噬機(jī)制初步重構(gòu)了家蠶中的自噬通路。這個(gè)自噬通路可以進(jìn)一步劃分為上游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和下游的兩個(gè)重要的ubiquitin-like結(jié)合通路。我們通過(guò)RT-PCR的方法證實(shí)了一些重要的自噬相關(guān)基因在絲腺中的表達(dá)，肯定了自噬機(jī)制在絲腺組中的作用。此外，為了驗(yàn)證蛹前期家蠶絲腺中自噬水平的變化，我們針對(duì)兩個(gè)自噬的標(biāo)志性基因BmAtg8和BmAtg12，進(jìn)行