幾類蛋白酶催化機理的理論研究.pdf

1、酶是生物體內(nèi)具有高度專一催化活性的生物大分子，被喻為生命體中的催化劑。由于酶催化并主導(dǎo)生物體的主要新陳代謝過程，它是生物體內(nèi)賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)。除少數(shù)幾個具有催化活性的DNA和RNA分子外，生物體內(nèi)所有酶的化學(xué)本質(zhì)都為蛋白質(zhì)。隨著酶學(xué)的不斷發(fā)展，酶催化已被越來越多的應(yīng)用到與人們生活息息相關(guān)的領(lǐng)域，如醫(yī)藥衛(wèi)生、食品和能源等。從原子水平上對酶催化反應(yīng)過程進行研究，有助于人們從化學(xué)本質(zhì)上去認(rèn)識酶及其催化規(guī)律，進而可以幫助人們對酶進行改造或者對

2、其進行修飾，使其發(fā)揮出更大的利用價值。雖然可以通過實驗方法對酶進行結(jié)晶并得到一些關(guān)鍵殘基對酶催化活性的影響信息，但是，關(guān)于酶催化反應(yīng)的本質(zhì)及詳細的反應(yīng)路徑目前僅靠實驗手段獲得還非常困難。而理論計算方法可以從微觀水平上提供許多實驗無法直接預(yù)測的化學(xué)反應(yīng)細節(jié)以及分子結(jié)構(gòu)等信息，使它成為科研工作者研究酶催化反應(yīng)的一種重要工具之一。特別是近年來隨著計算機技術(shù)的不斷發(fā)展以及理論化學(xué)方法的不斷完善，理論研究在酶催化研究領(lǐng)域有著較為突出的優(yōu)勢。

3、>　　本論文主要利用量子力學(xué)和分子力學(xué)相結(jié)合的QM/MM方法對幾類蛋白酶的催化機理進行了系統(tǒng)的理論研究。通過研究，我們對于底物與蛋白酶之間的作用機制有了更深刻的認(rèn)識，獲得了這些蛋白酶催化反應(yīng)的最可能路徑以及化學(xué)鍵形成和斷裂過程的具體細節(jié)，闡明了一些活性口袋的殘基在催化反應(yīng)中的不同作用和決定蛋白酶催化活性的關(guān)鍵因素，這些研究結(jié)果不僅有助于進一步理解這些蛋白酶的生物學(xué)功能，還可為相關(guān)酶的實驗研究和應(yīng)用提供重要的參考。
　　本論文工作主

4、要包括以下內(nèi)容:
　　(1)7-羧基-7-脫氮鳥嘌呤合成酶(QueE)催化機理研究。
　　自然界中的許多核苷類似物都含有7-脫氮鳥嘌呤結(jié)構(gòu)單元，它們一般具有較好的抗腫瘤及抗菌活性。7-脫氮鳥嘌呤類化合物的生物合成涉及到四種酶，即GCHI，QueC，QueD和QueE，其中7-羧基-7-脫氮鳥嘌呤合成酶(QueE)是一種S-腺苷甲硫氨酸(SAM)自由基依賴酶，它主要催化6-羧基-5，6，7，8-四氫蝶呤(CPH4)重排生成7-

5、羧基-7-脫氮鳥嘌呤(CDG)。雖然QueE屬于自由基SAM依賴酶，但它的結(jié)構(gòu)特征與一般自由基SAM酶不同，并表現(xiàn)出一定的金屬依賴性，它是目前發(fā)現(xiàn)的第一種金屬依賴的SAM自由基酶，如Mg2+可使B.multivorans體內(nèi)的QueE的催化活性提高三倍，但Na+卻不能使QueE的活性提高。此外，相同的金屬離子對來源不同的QueE的影響也不同。有人提出7-羧基-7-脫氮鳥嘌呤合成酶的催化過程涉及到復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重排，對于CPH4的閉環(huán)有兩種觀

6、點:一種觀點是重排過程要經(jīng)過一個橋鍵中間體，而另外一種觀點則認(rèn)為反應(yīng)要經(jīng)過一個開環(huán)過程，特別是QueE催化的具體反應(yīng)機理及鈉、鎂離子對反應(yīng)的影響機制還不明確?；谀壳暗玫降?-羧基-7-脫氮鳥嘌呤合成酶結(jié)合底物的晶體結(jié)構(gòu)，本論文用量子力學(xué)和分子力學(xué)相結(jié)合的QM/MM方法對7-羧基-7-脫氮鳥嘌呤合成酶的催化機理進行了研究。結(jié)果表明，產(chǎn)物分子五元環(huán)的形成是通過一個橋鍵中間體的重構(gòu)完成的。谷氨酸殘基(Glu116)通過一個水分子奪取底物分子

7、五元環(huán)pro-R C7位上的質(zhì)子使底物分子芳香化，從而得到最終的產(chǎn)物。相比Mg2+，Na+顯著提高了反應(yīng)的能壘，并改變了反應(yīng)的決速步。在整個催化反應(yīng)過程中，Mg2+和Na+不僅起到路易斯酸的作用，而且能通過與底物的相互作用固定底物的反應(yīng)構(gòu)型。Mg2+和Na+與底物分子之間配位方式不同是導(dǎo)致QueE-Mg2+和QueE-Na+具有不同活性的主要原因。通過理論研究，本文給出了QueE催化的詳細反應(yīng)機理，闡述了金屬離子對反應(yīng)的影響，給出了自由

8、基反應(yīng)傳遞的規(guī)律，為QueE及其他自由基SAM依賴酶的研究提供了理論依據(jù)。
　　(2) R-羥氰裂解酶(HNL)催化機理研究。
　　羥氰裂解酶(HNL)主要催化手性氰醇裂解生成氫氰酸(HCN)和相應(yīng)的醛或酮。裂解產(chǎn)物HCN是生氰植物抵御微生物和食草動物攻擊的有效武器，HCN還可以作為天冬酰胺生物合成途徑中的氮源。重要的是，羥氰裂解酶的逆反應(yīng)可以用非天然手性的HCN和相應(yīng)的醛或酮合成具有手性的氰醇。手性氰醇是一些藥物、農(nóng)藥和化

9、學(xué)試劑合成途徑中的重要中間體，目前很難通過一般的化學(xué)方法合成。從擬南芥（Arabidopsis thaliana）體內(nèi)得到的羥氰裂解酶(AtHNL)是目前發(fā)現(xiàn)的第一個含有α/β-水解酶折疊結(jié)構(gòu)的R選擇性羥氰裂解酶。AtHNL的發(fā)現(xiàn)打破了人們普遍認(rèn)為的只有S選擇性羥氰裂解酶才具有α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)的的觀點。AtHNL主要催化R手性中心氰醇的裂解反應(yīng)，定點突變實驗證明，His236、Ser81和Asp208對酶催化有著重要影響。雖然實驗學(xué)

10、家對AtHNL進行了大量的突變及實驗研究，但是AtHNL的具體催化反應(yīng)機理還不明確。針對AtHNL的催化反應(yīng)機理主要有兩種，一種是Ser81親核進攻機理，一種是廣義酸堿催化機理，人們對AtHNL采用何種催化機理尚有爭論?；?012年得到的AtHNL的晶體結(jié)構(gòu)，本文對AtHNL的催化機理進行了研究。本論文根據(jù)活性中心結(jié)構(gòu)的不同構(gòu)建了兩個計算模型，提出了兩條可能的反應(yīng)路徑。結(jié)果表明，AtHNL的催化反應(yīng)采用廣義酸堿催化機理，由于計算得到的

11、路徑A和路徑B的自由能能壘相似，并且都與實驗值符合較好，因此，這兩條反應(yīng)路徑都是可行的。在催化反應(yīng)中，催化三聯(lián)體（His236，Ser81和Asp208）作為廣義的酸堿起重要的催化作用，His236作為質(zhì)子的供體與受體，Ser81作為質(zhì)子的傳遞者。反應(yīng)中生成的氰根離子主要被殘基Ser81上的羥基和Ala13、Phe82主鏈上的氨基所穩(wěn)定，這些研究結(jié)果可為其生物催化HCN的合成提供一定的理論指導(dǎo)。
　　(3)甲基鳥氨酸合成酶(Pyl

12、B)催化機理研究。
　　吡咯賴氨酸是目前人們發(fā)現(xiàn)的由自然遺傳密碼編譯的第22種氨基酸，吡咯賴氨酸的發(fā)現(xiàn)極大的增加了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性。在所有已知的甲胺合成甲烷的生物途徑中，都需要吡咯賴氨酸的存在。實驗證明，吡咯賴氨酸中的碳原子和氮原子皆來源于賴氨酸。在賴氨酸生物合成吡咯賴氨酸的途徑中涉及到甲基鳥氨酸合成酶(PylB)，它屬于自由基SAM依賴酶，主要利用自由基機理催化(2S)-賴氨酸轉(zhuǎn)化生成為(2R，3R)-3-甲基鳥氨酸。反應(yīng)中，

13、L-賴氨酸的S手性中心被反轉(zhuǎn)為甲基鳥氨酸中的R手性。PylB的催化反應(yīng)機理涉及到賴氨酸的碎片重排變位反應(yīng)。本文利用了量子力學(xué)和分子力學(xué)相結(jié)合的QM/MM方法研究了甲基鳥氨酸合成酶的催化機理。結(jié)果表明，整個催化反應(yīng)由七步基元反應(yīng)構(gòu)成，其中賴氨酸Cα-Cβ鍵的均裂和甘氨?；杂苫c氨基丁烯的結(jié)合都對應(yīng)較高的反應(yīng)能壘(分別為23.0kcal/mol和24.1kcal/mol)，都決定了整個催化反應(yīng)的速率，反應(yīng)中產(chǎn)生的氨基丁烯碎片在活性中心內(nèi)的

14、旋轉(zhuǎn)可以很好的解釋最終產(chǎn)物的立體選擇性。本論文的計算結(jié)果不僅很好的解釋了實驗現(xiàn)象，還可為自由基反應(yīng)機理的進一步研究提供參考。
　　(4)1，2-環(huán)己二酮水解酶(CDH)催化機理研究。
　　硫胺素焦磷酸(ThDP)是維生素B1的生物活性代謝產(chǎn)物，是許多酶的重要輔因子，在許多體內(nèi)代謝過程中起著重要作用，是維持消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的正常運轉(zhuǎn)不可或缺的物質(zhì)。1，2-環(huán)己二酮水解酶(CDH)是2011年發(fā)現(xiàn)的一類ThDP依賴酶，它

15、是脂環(huán)醇類化合物的α-雙酮生物降解途徑中所必需的酶。脂環(huán)醇類化合物是自然界中廣泛存在的二級代謝產(chǎn)物，它們是合成一些化工產(chǎn)品的重要中間體，可以用來合成殺蟲劑和除草劑。在脂環(huán)醇類化合物的α-雙酮生物降解途徑中，CDH主要催化1，2-環(huán)己二酮(CDO)水解生成6-氧代己酸。CDH是目前發(fā)現(xiàn)的第一個α-酮醇酶和第一個涉及到脂環(huán)醇類化合物碳-碳鍵斷裂開環(huán)反應(yīng)的ThDP依賴酶。雖然人們已經(jīng)用實驗方法對CDH的催化反應(yīng)進行了研究，但是它的催化反應(yīng)機理

16、還不明確。本文利用QM/MM方法對CDH的催化機理進行了研究。由于1,2-環(huán)己二酮在溶劑中以一水化酮的形式存在，根據(jù)CDO不同的質(zhì)子化狀態(tài)，本論文構(gòu)建了三種反應(yīng)模型。在模型A中，整個催化反應(yīng)通過五步基元反應(yīng)來完成，其中C1(CDO)-C2(ThDP)鍵的斷裂對應(yīng)較高的反應(yīng)能壘(19.9kcal/mol)，為整個催化反應(yīng)的決速步。在模型B和B'中，只有模型B能夠?qū)е翪DO轉(zhuǎn)化為6-氧代己酸，相應(yīng)的催化反應(yīng)包括三個基元步驟。本論文的計算結(jié)果

17、顯示CDO的去質(zhì)子化狀態(tài)可以有效的促進底物分子C-C鍵的斷裂。本論文對CDH進行的理論研究可以更好的幫助人們理解CDH及其他ThDP依賴酶的催化性能。
　　(5)人類去泛素化酶(AMSH-LP)催化機理研究。
　　泛素分子是所有真核細胞中都存在的一種小型蛋白質(zhì)，它可以通過其末端殘基連接到目標(biāo)蛋白上來對蛋白質(zhì)分子進行翻譯后修飾。與其它翻譯后修飾一樣，泛素化過程也是可逆的。去泛素化酶(DUB)主要催化多聚泛素鏈中異肽鍵的水解反應(yīng)

18、，以此來調(diào)節(jié)和控制細胞中的去泛素化過程。雖然科學(xué)家們對DUB進行了一些實驗研究，但其催化機理目前還不清楚。人體內(nèi)去泛素化酶AMSH-LP專一性的催化裂解Lys63-連接多聚泛素鏈中的異肽鍵。并表現(xiàn)出一定的金屬鋅離子依賴性。本文利用量子力學(xué)和分子力學(xué)相結(jié)合的QM/MM方法對人類去泛素化酶AMSH-LP的催化機理進行了研究。計算結(jié)果表明，Zn2+配體水分子的活化過程對于異肽鍵的水解反應(yīng)是必須的，羥基的親核進攻過程要先于Lys63氨基的質(zhì)子化

19、過程。Zn2+在反應(yīng)中除了作為路易斯酸之外，還可以通過調(diào)節(jié)它的配位環(huán)境來影響反應(yīng)進程，這些研究結(jié)果可為探索去泛素化酶的生物學(xué)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　本論文的特色和創(chuàng)新之處
　　1)利用QM/MM方法系統(tǒng)研究了7-羧基-7-脫氮鳥嘌呤合成酶的催化機理，確定了底物分子的閉環(huán)反應(yīng)是通過一個橋鍵中間體完成的，排除了開環(huán)中間體機理。通過比較鈉鎂離子對酶活性中心結(jié)構(gòu)和對反應(yīng)路徑能壘的影響，解釋了鈉、鎂離子在反應(yīng)中所起的作用，給出了

20、自由基SAM依賴酶催化的一般規(guī)律，為今后對自由基SAM酶催化反應(yīng)的進一步研究提供了理論基礎(chǔ)。
　　2)利用QM/MM方法對R-羥氰裂解酶（AtHNL）的廣義酸堿催化機理進行了研究。在研究中充分考慮了周圍殘基對反應(yīng)的影響，通過勢能面掃描確定了反應(yīng)中最可能的反應(yīng)路徑及反應(yīng)細節(jié)，解釋了催化三聯(lián)體（His236，Ser81和Asp208）在催化反應(yīng)中的作用，研究結(jié)果對于手性氰醇生物合成具有指導(dǎo)意義。
　　3)使用QM/MM方法對人類