羅格列酮對慢性溫和不可預知應激所致小鼠抑郁癥的治療作用及機制.pdf

1、抑郁癥(depression)是心境障礙的一種，其主要臨床特征是心境低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀。據(jù)WHO最新的統(tǒng)計結果顯示，全球抑郁癥患病率高達12.8％，并預測2020年抑郁癥將成為全球第二位醫(yī)療疾患。目前臨床常用的抗抑郁藥治療作用有限，并且副作用明顯。因此，尋求安全可靠且治療效果顯著的抗抑郁藥迫在眉睫。
　　抑郁癥患者中常出現(xiàn)前額葉-邊緣系統(tǒng)的葡萄糖低代謝特征，提示能量代謝損傷可能都是抑郁癥臨床癥狀產(chǎn)

2、生的神經(jīng)生物學基礎。除此之外，抑郁癥和代謝性疾病還存在很多共同的病理特征，如血糖代謝失衡、慢性炎癥反應、神經(jīng)-內(nèi)分泌紊亂等。因此，抑郁癥與代謝性疾病有著十分密切的關系。
　　羅格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物(Thiazolidinedione，TZD)，臨床上作為胰島素增敏劑用于治療2型糖尿病。越來越多的研究證實羅格列酮對包括腦卒中、阿爾茨海默病在內(nèi)的多種神經(jīng)精神類疾病具有神經(jīng)保護作用。但是，羅格列酮在抑郁癥中的作用及機制尚不清楚。本

3、文從在體（慢性溫和不可預知應激所致抑郁癥模型小鼠）和離體（皮質(zhì)酮誘導損傷的細胞模型）水平評價羅格列酮對抑郁癥的潛在治療作用及機制。研究結果將為抑郁癥治療提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　目的:
　　研究、闡明羅格列酮對抑郁癥模型小鼠的實驗性治療作用及機制。
　　方法:
　　1.應用糖水偏愛測試(sucrose preference test，SPT)、強迫游泳(forcedswimming test，F(xiàn)ST)和開場(

4、open field test，OFT)等行為學實驗，評價小鼠CMS模型及羅格列酮對抑郁樣行為的影響。
　　2.免疫熒光技術(immunofluorescence，IF)檢測前額葉皮層和海馬石蠟切片中NeuN標記的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein，GFAP)標記的星形膠質(zhì)細胞和CD11b標記的小膠質(zhì)細胞數(shù)量、形態(tài)及相關蛋白的表達情況。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附法(enz

5、yme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測動物血清中IL-6、TNFα、IGF1、VEGF、CNTF的濃度
　　4.培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及N2a細胞系，應用免疫細胞化學(immuno cytochemistry，ICC)染色結合體視學技術，檢測細胞陽性率。
　　5.用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)或者乳酸脫氫酶(lactic

6、dehydrogenase，LDH)法檢測細胞活力。
　　6.透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察細胞自噬小體的形成及數(shù)量。
　　7.采用Annexin-Ⅴ和PI對星形膠質(zhì)細胞進行雙染，并用流式細胞分選儀檢測原代星形膠質(zhì)細胞的凋亡率。
　　8.應用免疫印跡法(western blotting，WB)檢測動物組織及細胞樣本中自噬相關蛋白LC3、AMPK、P62、ULK1

7、及凋亡相關蛋白caspase3、Bax、Bcl-2、PARP的表達情況。
　　9.實時定量聚合酶鏈反應技術(real-time quantification polymerase chainreaction，RT-qPCR)檢測細胞轉(zhuǎn)染si-PPARγ的效率及細胞因子和STRAD、MO25的表達情況。
　　結果:
　　1.羅格列酮改善CMS引起的小鼠抑郁樣行為
　　羅格列酮（5 mg/ml）能升高CMS模型小鼠的

8、糖水偏愛率，并使其平均體重增加3.7 g;與CMS組小鼠相比，羅格列酮能顯著增加小鼠在FST中的運動時間，延長小鼠在OFT中的中心停留時間。
　　2.羅格列酮能緩解CMS引起的前額葉皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞損傷，并增強海馬區(qū)的神經(jīng)再生能力
　　應用TUNEL染色顯示，羅格列酮能減少皮層細胞的凋亡;通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，羅格列酮能夠增加CMS小鼠前額葉皮層中星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量，并改善神經(jīng)元軸突的密度。同時，羅格列酮增加海馬CA

9、1區(qū)中Ki67標記的新生神經(jīng)元數(shù)目，表明羅格列酮具有改善抑郁癥小鼠神經(jīng)再生的作用。
　　3.羅格列酮能抑制小鼠體內(nèi)的炎癥反應，改善細胞因子分泌的紊亂
　　通過qPCR和ELISA實驗發(fā)現(xiàn)，CMS造模導致小鼠血清和前額葉皮層中IL-1β、IL-6、TNFα的濃度及mRNA水平升高，而羅格列酮能逆轉(zhuǎn)這些炎癥因子的升高趨勢;羅格列酮還能增加血清中CNTF和IGF1的濃度;使血清中皮質(zhì)酮的濃度下降至366 ng/ml（CMS組為71

10、3 ng/ml）。
　　4.羅格列酮上調(diào)前額葉皮層神經(jīng)元自噬水平并抑制凋亡
　　羅格列酮使自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、ULK1、Beclin1及p-AMPK/AMPK表達升高，而降低P62的表達。隨后的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，與CMS組相比，羅格列酮使NeuN標記陽性神經(jīng)元中LC3B的表達升高約68％。另外，羅格列酮促進Bcl-2/Bax、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt和p-IRS1/IRS1等蛋白表達。
　　5.

11、羅格列酮通過激活LKB1/AMPK通路，促進原代皮層神經(jīng)元和N2a細胞的自噬
　　皮質(zhì)酮(10μM)刺激導致原代皮層神經(jīng)元和N2a細胞活力降低，而羅格利酮給藥可以對抗皮質(zhì)酮所致細胞的損傷。應用透射電鏡觀察結果顯示，羅格列酮能增加自噬小體的形成;進一步對自噬相關蛋白ATG5、LC3、ULK1、P62等表達的分析表明，羅格列酮能逆轉(zhuǎn)CMS引起的自噬水平降低。羅格列酮所引起的上述改變均可被PPARγ拮抗劑T0070907阻斷;敲低和過表

12、達PPARγ表達后，羅格列酮能明顯降低或升高LKB1、STRAD、MO25的表達，從而影響羅格列酮對N2a細胞的神經(jīng)保護作用。這些結果提示，羅格列酮作用于PPARγ、激活LKB1/AMPK通路，從而促進神經(jīng)元自噬，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。
　　6.羅格列酮通過增加IGF1R的表達、激活Akt/CREB通路，抑制皮質(zhì)酮所致星形膠質(zhì)細胞的損傷
　　應用流式細胞術檢測AV/PI雙染細胞、WB分析Bcl-2/Bax、caspase3、PA

13、RPp85等蛋白的表達，結果顯示:羅格列酮具有抗凋亡作用。IGF1R在星形膠質(zhì)細胞中表達明顯高于神經(jīng)元;羅格列酮增加IGF1R及其底物IRS1的磷酸化表達（分別增加約175％和86％），促進下游Akt、CREB的磷酸化，進而起到保護星形膠質(zhì)細胞的做用。
　　7.羅格列酮改善皮質(zhì)酮誘導的星形膠質(zhì)細胞功能紊亂，進而保護皮層神經(jīng)元
　　應用皮質(zhì)酮和羅格列酮處理的星形膠質(zhì)細胞所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元，結果顯示條件培養(yǎng)基能

14、對抗皮質(zhì)酮所致神經(jīng)元損傷、使細胞活力增加49％，同時細胞核皺縮的神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。應用MAP2熒光探針標記條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基具有促進神經(jīng)元軸突生長的作用。
　　結論:
　　羅格列酮通過促進神經(jīng)元自噬、抑制星形膠質(zhì)細胞凋亡，從而發(fā)揮抗抑郁效應。
　　本文工作的主要創(chuàng)新之處:
　　1.發(fā)現(xiàn)羅格列酮能減輕CMS和皮質(zhì)酮所致神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細胞損傷的作用，為將其發(fā)展為抑郁癥藥物提供了實驗依據(jù);