黃精多糖干預(yù)去卵巢大鼠、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及破骨細(xì)胞后microRNA的差異表達(dá)及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)由女性絕經(jīng)后卵巢功能減退、雌激素水平下降所致，易引起骨形成與骨吸收之間的動態(tài)平衡失調(diào)，嚴(yán)重者易發(fā)生骨折，嚴(yán)重影響患者的健康。目前，治療骨質(zhì)疏松的藥物日益具有靶向性，抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)由細(xì)胞活性水平發(fā)展至信號通路水平，為骨質(zhì)疏松精確治療開辟了新的道路。黃精多糖是中藥黃精的主要成分，具有抗氧化、抗炎、降低血糖血脂及延緩衰老的作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖具有抗骨質(zhì)疏松的作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步

2、研究。microRNAs(miRNAs)具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、脂肪代謝和激素分泌功能的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，具有高度保守性。研究表明miRNAs能調(diào)控骨質(zhì)疏松相關(guān)過程，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化過程，是某些骨代謝疾病的重要調(diào)控因子之一。因此，本實(shí)驗(yàn)探討黃精多糖對去卵巢大鼠、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和骨髓源性單核巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞過程中miRNAs表達(dá)譜的影響，為黃精多糖抗骨質(zhì)疏松的精確治療提供

3、研究基礎(chǔ)。
　　內(nèi)容:
　　1.通過摘除大鼠雙側(cè)卵巢建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察黃精多糖對骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中miRNA表達(dá)的影響。
　　2.通過誘導(dǎo)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，觀察黃精多糖對大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化過程中miRNA表達(dá)的影響。
　　3.通過誘導(dǎo)大鼠骨髓源性單核巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，觀察黃精多糖對大鼠骨髓源性單核巨噬細(xì)胞向破骨分化中miRNA表達(dá)的影響。
　　4.預(yù)測表達(dá)顯著下調(diào)

4、的rno-miR-1224靶基因，觀察黃精多糖基于Hippo信號通路對破骨細(xì)胞的影響。
　　方法:
　　1.摘除雌性大鼠雙側(cè)卵巢，建立絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松模型。(1)每周測量大鼠體重變化情況;(2)雙能X射線骨密度儀法測量各組大鼠全身骨密度(BMD);(3) Elisa法和分光光度法檢測大鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、鈣(Ca)和磷(P)含量;(4) Micro-CT法觀察大鼠脛

5、骨干骺端顯微結(jié)構(gòu)變化情況;(5)全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)OVX組和H-PSP組原代離體骨髓基質(zhì)細(xì)胞，抽提RNA后進(jìn)行miRNA芯片檢測。
　　2.建立大鼠BMSCs誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞模型。(1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，顯微鏡下觀察P3代大鼠細(xì)胞形態(tài)變化情況;(2)MTT法檢測不同劑量黃精多糖對大鼠BMSCs細(xì)胞增殖的影響;(3)誘導(dǎo)21d后，觀察各組堿性磷酸酶(ALP)染色情況;(4)誘導(dǎo)28d后，各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，觀察礦

6、化變化情況;(5)誘導(dǎo)7/14/21d，qRT-PCR法檢測成骨相關(guān)基因ALP，Runx2，OCN mRNA表達(dá)情況;(6)以25mg/L黃精多糖誘導(dǎo)21d提取的RNA進(jìn)行miRNA芯片檢測。
　　3.建立大鼠原代骨髓源性巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞模型。(1)原代大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)，顯微鏡下觀察原代大鼠BMMs形態(tài)變化情況;(2)誘導(dǎo)7d，觀察TRAP染色結(jié)果;(3)誘導(dǎo)7d，提取各組細(xì)胞RNA進(jìn)行miRNA芯片檢測

7、。
　　4.(1) mirPath v.3預(yù)測rno-miR-1224調(diào)控的靶基因;(2) Western-blot法檢測0、15、30、60min四個時間點(diǎn)黃精多糖對Limd1、Mst1、Lats1、TAZ、TEAD3、CTGF蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.(1)OVX組大鼠體重較Sham組顯著增加，給藥4周后，H-PSP組大鼠體重較OVX組顯著降低，給藥8周后，H，M-PSP組大鼠體重較OVX組顯著降低;(

8、2) OVX組大鼠全身骨密度較Sham組顯著降低，給藥8周后，H-PSP組骨密度較OVX組顯著增加;(3) OVX組大鼠血清ALP、OC、TRAP、Ca和P較Sham組均顯著增加，給予不同劑量黃精多糖后，H-PSP組ALP、TRAP和P含量較OVX組顯著降低，H，M-PSP組OC含量顯著降低，黃精多糖各劑量組Ca含量顯著降低;(4)黃精多糖各劑量組BV/TV、Tb.N和Tb.Th等指標(biāo)較OVX組均有不同程度增加，Tb.Sp降低;(5)

9、microRNA微陣列芯片分析結(jié)果顯示表達(dá)差異的miRNAs有15個，明顯表達(dá)上調(diào)的有6個，明顯表達(dá)下調(diào)的有9個。
　　2.(1)大鼠BMSCs生長呈長梭形，極性排列，成骨誘導(dǎo)分化后呈短梭形，體積變大;(2) MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，各劑量黃精多糖組所測OD值無顯著差異;(3) ALP染色呈深色塊狀，細(xì)胞膜和細(xì)胞胞漿呈藍(lán)黑色;(4)25mg/L黃精多糖組礦化結(jié)節(jié)數(shù)較對照組顯著增多，呈深紅色;(5)不同劑量黃精多糖能顯著提高成骨分

10、化相關(guān)基因ALP、COL和OCNmRNA表達(dá);(6) microRNA微陣列芯片分析結(jié)果顯示表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA有3個。
　　3.(1) TRAP染色胞漿呈紅色，可見空泡，一胞多核，煎雞蛋樣成熟破骨細(xì)胞情況;(2) microRNA微陣列芯片分析結(jié)果顯示表達(dá)有差異的miRNA有27個，明顯表達(dá)上調(diào)的有3個，明顯表達(dá)下調(diào)的有24個。
　　4.(1)預(yù)測miR-1224調(diào)控的靶基因?yàn)長imd1;(2) Limd1在30、60

11、min蛋白表達(dá)顯著減少，Mst1、Lats1在30、60min表達(dá)減少，TAZ在60min上顯著減少，TEAD3在30、60min相對減少，CTGF在15min表達(dá)顯著減少。
　　結(jié)論:
　　(1)黃精多糖可以抵抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨量的下降，具有抗骨質(zhì)疏松的作用;
　　(2)miRNA的表達(dá)對調(diào)控在體大鼠骨量，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞和骨髓源性巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞三個過程有重要作用;
　　(3) m