檸條錦雞兒肉桂酸-4-羥基化酶基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、苯丙烷途徑是植物特有的次生代謝途徑,也是植物三大次生代謝途徑之一。在維管植物中，苯丙烷的終產(chǎn)物主要用于合成木質(zhì)部的木質(zhì)素單體和在色素合成、藥物成分及微生物與植物互作方面都發(fā)揮重要作用的黃酮類物質(zhì)。肉桂酸-4-羥基化酶催化苯丙烷途徑中的第二步反應(yīng)，將反式肉桂酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?羥基肉桂酸(即對(duì)羥基香豆酸)，在整個(gè)途徑中起著十分重要的作用。本研究首次從檸條錦雞兒中克隆到肉桂酸-4-羥基化酶基因并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)分析，具體結(jié)果如下：
　　1運(yùn)用R

2、T-PCR及 RACE技術(shù)從檸條錦雞兒中克隆到一條肉桂酸-4-羥基化酶基因的全長(zhǎng) cDNA序列(命名為 CkC4H)，GenBank登錄號(hào)為 HQ829860。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) CkC4H長(zhǎng)1685bp，具有完整的ORF，預(yù)測(cè)編碼505個(gè)氨基酸，分子量為57850.1D。結(jié)構(gòu)域分析表明 CkC4H蛋白具有信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和典型的細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)域特征。CkC4H對(duì)應(yīng)的gDNA序列全長(zhǎng)4718bp，有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。

3、>　　2應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR方法檢測(cè)檸條錦雞兒不同組織部位 CkC4H的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，CkC4H基因在不同組織部位表達(dá)情況有所不同，其中根中表達(dá)量最高，莖中次之，葉中表達(dá)量最低。受到創(chuàng)傷后，莖與葉中 CkC4H基因均可被誘導(dǎo)表達(dá)，最高表達(dá)量出現(xiàn)在4小時(shí)左右，且葉中的誘導(dǎo)水平高于莖中。
　　3構(gòu)建了過表達(dá)雙元載體35S::CkC4H并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，在 T3代轉(zhuǎn)基因植物中共鑒定出8個(gè) CkC4H過表達(dá)純合株系。采用實(shí)時(shí)熒光