華細(xì)辛肉桂酸-4-羥基化酶基因的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析.pdf

1、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）催化反式肉桂酸在苯環(huán)4位上的羥基化反應(yīng)生成4-香豆酸，是苯丙素類(lèi)化合物生物合成共有途徑的關(guān)鍵酶之一。細(xì)辛藥理活性部位揮發(fā)油中的主要組成成分甲基丁香酚等芳香族化合物都屬于苯丙素類(lèi)化合物。因此，分離細(xì)辛C4H基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證，是闡明細(xì)辛主要活性成分生物合成分子調(diào)控機(jī)制、掌握細(xì)辛藥效成分積累動(dòng)態(tài)規(guī)律、開(kāi)展細(xì)辛種質(zhì)遺傳改良、提升細(xì)辛藥材品質(zhì)等的理論基礎(chǔ)。
　　本研究基于同源克隆的原理和方法，通過(guò)在Geneb

2、ank中搜索不同植物類(lèi)群肉桂酸-4-羥基化酶基因C4H的序列并進(jìn)行比對(duì)，查找該基因的保守序列。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以華細(xì)辛總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增獲得保守片段，大小約為850 bp。依據(jù)獲得的保守片段的序列信息，設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增特異引物，采用cDNA末端快速擴(kuò)增法分別得到華細(xì)辛C4H基因5'端片段和3'端片段。經(jīng)5'端片段、保守片段和3'端片段拼接，得到堿基數(shù)為1698 bp的華細(xì)辛C4H cDNA全長(zhǎng)。利用在線(xiàn)分析工具及軟

3、件，對(duì)華細(xì)辛C4H基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，了解其編碼蛋白的各級(jí)結(jié)構(gòu)。利用熒光定量PCR方法，比較華細(xì)辛C4H基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同組織部位的表達(dá)量，結(jié)果顯示該基因在華細(xì)辛幼苗期的表達(dá)量大于花期，根中的表達(dá)量遠(yuǎn)大于葉柄和葉片中的表達(dá)量。
　　本研究以細(xì)辛三個(gè)基源物種之一的華細(xì)辛為材料，首次從細(xì)辛類(lèi)中藥中分離獲得了C4H基因，對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)水平分析，為細(xì)辛活性成分生物合成表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，以及細(xì)辛遺傳品質(zhì)的改良