2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、引言
  結直腸癌,發(fā)病率位于全世界常見惡性腫瘤的第3位,在消化道腫瘤中發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌。在中國上海地區(qū),結直腸癌患病率在各癌癥中排列第3位,發(fā)病率為23.5/10萬,而死亡率為11.8/10萬。結直腸癌的臨床癥狀以腹瀉、便秘、腫塊、便血、貧血、腸梗阻為主,晚期多出現(xiàn)肝、肺和腹腔內轉移,西醫(yī)診斷主要通過直腸指診、x線造影、內窺鏡檢查和病理檢驗確定。約半數結直腸癌患者可生存5年左右。外科手術切除和放射治療是治療結直腸癌常用的

2、治療手段,但其單獨治療療效不佳,為了預防癌的復發(fā)和轉移,減輕患者痛苦,提高生活質量,越來越多的植物源化合物被用于抗癌的藥物治療和化學預防。Newman等統(tǒng)計在1981-2006年間,所有被批準的抗癌藥物中,約73%的藥物是屬于天然產品藥物,或者是基于天然產品的系列藥物,天然藥物因其多靶點、多環(huán)節(jié)和多途徑的抗腫瘤作用,日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點。
  南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)為衛(wèi)矛科南

3、蛇藤屬落葉木質藤本植物,其莖、根、葉和果均可入藥,現(xiàn)代工藝從南蛇藤葉、根皮、莖、葉、種子等部位分離到多種成分,主要有倍半萜、三萜類、黃酮類、有機酸類、甾體類、鞣質等,具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等多種作用。其中,南蛇藤莖乙酸乙酯總萜(C.orbiculatus ethyl acetate extract,COE)的抗腫瘤作用已被廣泛證實,以往的研究多集中在對腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移和血管生成等方面,關于其在腫瘤細胞自噬與

4、凋亡方面的研究甚少。
  前期研究發(fā)現(xiàn),COE可抑制人結直腸癌HT-29細胞的增殖,誘導細胞自噬和凋亡,同時發(fā)現(xiàn)COE可降低CSN6蛋白表達水平。CSN6屬于CSN的第六亞基,對于哺乳動物的生長發(fā)育非常重要,CSN6基因缺失或蛋白降解都會導致胚胎的死亡,從這些死亡的胚胎中可以發(fā)現(xiàn)p53及p21升高及細胞凋亡,在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)CSN6過表達,其主要功能是調控蛋白質泛素化過程中的泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzy

5、me,E3)活性而起作用,但是,CSN6對結直腸癌細胞凋亡與自噬的調節(jié)作用還不很清楚,CSN6是否參與COE抑制結直腸癌的作用未見報道。因此,本實驗擬研究CSN6分子是否參與調節(jié)COE誘導的HT-29細胞凋亡與自噬。
  本課題共分為三部分研究內容。
  第一部分:CSN6、Myc蛋白在人結直腸癌組織中的表達及臨床意義
  目的:檢測結直腸癌組織及癌旁組織中CSN6、Myc表達,分析CSN6和Myc兩者相關性,并分析其

6、在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中的臨床意義。
  方法:選擇2012年1月至2014年12月手術切除后并經病理證實的結直腸癌患者48例,采用免疫組織化學的方法檢測CSN6、Myc蛋白在人結直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達情況;逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測癌組織及癌旁腸組織中CSN6mRNA、Myc mRNA,用x2檢驗或者Fisher確切概率法對資料進行描述,所有數據均采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析。
  結果

7、:免疫組織化學:CSN6蛋白陽性反應呈棕黃色,存在于結直腸癌細胞的細胞漿或胞核中,CSN6在結直腸癌中陽性表達率為70.8%(34/48),癌旁組織陽性表達率為10.4%(5/48);Myc在癌組織中的過表達率為83.3%,高于癌旁組織,差異有顯著性(P<0.05); RT-PCR示,CSN6mRNA和Myc mRNA在結直腸癌組織和癌旁組織中均有不同程度的表達,約75%(36/48)癌組織中CSN6 mRNA表達水平高于癌旁組織,77

8、.09%(37/48)癌組織中MycmRNA表達水平高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.001);二者表達呈正相關(r=0.652,p=0.041); CSN6 mRNA,Myc mRNA在Dukes C期+D期表達上調,與A期、B期比較,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),但A期與B期之間無顯著性差異;CSN6mRNA,Myc mRNA的表達,在淋巴結轉移陽性與陰性組間有顯著性差異(p<0.05),但在性別、年齡、病灶位置、組織類

9、型等組間表達無顯著性差異(p>0.05)。
  結論:(1)結直腸癌組織中CSN6mRNA、Myc mRNA的表達高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義,二者表達呈正相關(r=0.652,p=0.041);(2)癌組織中CSN6、Myc蛋白表達高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
  第二部分:南蛇藤總萜誘導人結直腸癌HT-29細胞凋亡與自噬的實驗研究
  目的:從細胞自噬及凋亡關系角度探討南蛇藤總萜(COE)抑制

10、人結直腸癌HT-29細胞增殖的作用機制。
  方法:選用不同濃度的COE處理體外培養(yǎng)的結直腸癌HT-29細胞,MTT法檢查細胞存活率,電鏡(TEM)觀察細胞形態(tài),流式細胞術(AnnexinⅤ,F(xiàn)ITC-PI雙染與PI單染法)檢測細胞凋亡與細胞周期,免疫印跡法(Western blot)檢測COE對細胞自噬及凋亡的相關蛋白表達的影響;為進一步探討COE誘導的自噬對凋亡的影響,用自噬激動劑Rapamycin和抑制劑3-MA聯(lián)合80 m

11、g/L COE干預HT-29細胞,用吖啶橙染色細胞,并采用MTT法檢測Rapamycin、3-MA調節(jié)自噬后,對COE抑制HT-29細胞增殖的影響。
  結果:COE抑制HT-29細胞的增殖,呈時間、劑量依賴性,作用24h的IC50為149.65μg/mL。隨著COE濃度的升高,TEM示細胞中凋亡小體及自噬體明顯增多,細胞凋亡率也明顯高于對照組,并且COE誘導HT-29細胞周期停滯于GOG1期,呈濃度依賴性;和COE治療組比較,C

12、OE聯(lián)合3-MA組的細胞生存率、AVO的數量顯著下降,免疫印跡分析,COE聯(lián)合3-MA組的LC3-Ⅱ蛋白表達也降低,相反,COE聯(lián)合Rapamycin組的AVO量增加、LC3-Ⅱ的表達上調,更重要的是,COE聯(lián)合Rapamycin組與COE聯(lián)合3-MA組比較,細胞生存率降低,這個結果表明,自噬可以促進COE抑制人結直腸癌HT-29細胞增殖。
  結論:COE可誘導HT-29細胞凋亡與自噬,并且自噬可以協(xié)同COE抑制人結直腸癌HT-

13、29細胞增殖。
  第三部分:COE誘導結直腸癌細胞凋亡及自噬的分子機制
  目的:探討Akt-CSN6-Myc信號軸是否參與COE誘導HT-29細胞凋亡與自噬.
  方法:首先用Western blot方法檢測COE不同濃度組對CSN6蛋白及其下游基因相關蛋白Myc、P53表達的影響;接著研究CSN6對結直腸癌HT-29細胞增殖的影響,成功構建了CSN6過表達質粒,并獲得了HT-29-MIGR1-CSN6細胞株,選用

14、80mg/L濃度的COE處理HT-29-MIGR1、HT-29-MIGR1-CSN6細胞24 h,Western blot檢測CSN6-Myc信號軸相關蛋白表達水平的變化,MTT法檢測各組細胞生存率;并探討Akt激酶對CSN6-Myc信號軸的影響,成功構建了Akt過表達質粒,并獲得了HT-29-MIGR1-Akt細胞株,選用80mg/L濃度的COE處理Akt激酶過表達組(HT-29-MIGR1-CSN6細胞組)、Akt激酶抑制組(用PI

15、3K抑制劑LY294002同時干預,終濃度50μM)24h,Western blot檢測p-Akt、CSN6、Myc、p53等蛋白表達變化;最后探討了COE對PI3K-Akt-mTOR信號傳導通路的影響。
  結果:隨著COE濃度的增加,CSN6、Myc蛋白表達水平逐漸下降,p53表達水平反而上升,40、80、160mg/L COE組與control組的差異有統(tǒng)計學意義;qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),CSN6 mRNA表達水平有一定的變

16、化,但與control組比較無顯著性差異(P>0.05),以上結果提示COE能夠下調CSN6蛋白的表達水平,但其蛋白質水平的改變不是通過調節(jié)細胞中mRNA的水平來實現(xiàn)的;相比control組,COE組、COE+HT-29-MIGR1組、COE+HT-29-MIGR1-CSN6組細胞生存率明顯下降,但是,COE+HT-29-MIGR1-CSN6組細胞生存率較COE組、COE+HT-29-MIGR1組,有所升高,以上實驗結果說明, COE可

17、通過降低CSN6蛋白表達,來抑制HT-29細胞的增殖;與control組比較,Akt激酶過表達組的Akt、p-Akt蛋白表達增高,其下游基因CSN6、Myc的蛋白表達水平也明顯升高,p53蛋白表達下降,Akt激酶抑制組的Akt、p-Akt、CSN6、Myc蛋白表達結果與之相反,COE處理后,HT-29-MIGR1-Akt細胞組的p-Akt、CSN6、Myc蛋白表達明顯下降,p53蛋白表達升高,上述結果說明,COE可抑制Akt磷酸化,從而

18、下調CSN6蛋白水平;同時,隨著COE濃度的增加,Akt-Thr308、mTOR-Ser2481、S6K-Thr389磷酸化水平逐漸下降,結果說明COE可通過抑制Akt磷酸化水平,下調mTOR、S6K的激酶活性從而抑制結直腸癌HT-29細胞增殖,誘導其凋亡,同時, mTOR活性的降低也可促進自噬的產生。
  結論:COE通過影響Akt-CSN6-Myc信號軸誘導人結直腸癌HT-29細胞凋亡與自噬。另外,對PI3K-Akt-mTOR

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