super-gfp轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)植株的獲得及其應(yīng)用.pdf

1、綠色熒光蛋白（GFP）是一種可溶性球蛋白，能在藍(lán)光或者紫外光下激發(fā)出綠色熒光，因此而得名。最初在水母（Aequorea victoria）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并提取的GFP含有238個(gè)氨基酸，性質(zhì)比較穩(wěn)定，其變性需在pH<4酸處理，或者pH>12堿處理，并能在變性后恢復(fù)中性環(huán)境會(huì)部分發(fā)生復(fù)性，且不影響其熒光特性。野生型的GFP的熒光并不十分強(qiáng)，為了能將GFP更好地應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)研究中，大量研究者們對(duì)水母GFP進(jìn)行改造，逐漸獲得一些熒光更強(qiáng)的人工改造的G

2、FP。
　　本文研究的GFP也是經(jīng)過人工改造過，為了驗(yàn)證其是否具有很強(qiáng)的熒光，并獲得能發(fā)熒光的植物材料，本文將super-gfp基因構(gòu)建到pMOG載體上，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥（Arabidopsis thaliana）和早花煙草（Nicotiana tabacum），來獲得熒光植物材料。同時(shí)，利用super-gfp基因改造pCAMBIA1301載體，利用綠色熒光來標(biāo)記啟動(dòng)子的表達(dá)部位；并構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體研究某些基因在細(xì)胞

3、中的表達(dá)部位。具體研究結(jié)果如下：
　　1.本研究通過擴(kuò)增super-gfp基因片段，并構(gòu)建到表達(dá)載體pMOG載體上，并通過酶切驗(yàn)證35S:super-gfp載體構(gòu)建成功。
　　2.本研究通過瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證35S:super-gfp載體在植物體內(nèi)能超量表達(dá)，并能發(fā)出強(qiáng)烈熒光；再分別通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染擬南芥花序和早花煙草的，轉(zhuǎn)化super-gfp基因到植物材料中，來獲得擬南芥轉(zhuǎn)化的種子和早花煙草愈傷組織及抗性芽，再通過抗生

4、素來篩選抗性擬南芥植株和早花煙草抗性芽。再通過體視熒光顯微鏡來觀察植株是否發(fā)熒光來進(jìn)一步確定陽性苗。目前已經(jīng)篩選出全株能發(fā)明亮熒光的擬南芥植株和早花煙草陽性苗。
　　3.本研究通過擴(kuò)增super-gfp基因片段，替換掉pCAMBIA1301載體上的GUS基因，通過super-gfp基因研究目的基因啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)。
　　4.本研究克隆了3個(gè)基因，分別為AT4G13990、AT2G20370、mrna02225，分別構(gòu)建到實(shí)驗(yàn)