重組Lac Z酵母細胞構建及對化學誘變原的高通量篩選研究.pdf

1、基因毒性(Genotoxic)是指能直接或間接損傷細胞DNA的性質。誘變原即具有基因毒性作用的化合物，它能夠改變機體細胞遺傳物質而誘發(fā)突變。當今，化學誘變原已成為危害環(huán)境和人類健康的一大類因素，防止這類化學污染物對環(huán)境污染成為人類預防癌癥的重要手段之一。
　　目前，人們已經提出多種對致突變化學誘變原毒性評價的試驗方法，如Ames試驗、微核和染色體試驗等。隨著科學技術的發(fā)展，一些常規(guī)的評價檢測方法的缺點逐漸突顯出來:敏感度低，耗時較

2、長，操作繁瑣以及成本過高等方面成為了影響對化學誘變原毒性評價的因素。本課題利用生物傳感器技術，與其中的微生物傳感器技術相結合，用重組的酵母細胞作為宿主細胞，用Lac Z作用為報告基因，利用經化學誘變原作用后表達產物可催化底物顯色這一特性，特性作為信號轉換的標識，評價致突變化學物的毒性作用強度。
　　化學誘變物主要分為兩類:直接化學誘變物和間接化學誘變物，前者對DNA具有直接損傷作用，后者自身對DNA無損傷作用，但其進入機體內可經某

3、些反應轉化為具有基因毒性作用的物質。本課題利用構建重組酵母細胞分別對直接和間接化學誘變物進行高通量篩選研究。
　　1.重組酵母細胞W303-1A/RNR3-LacZ的構建及對直接誘變物的篩選
　　目的:建立由RNR3調控重組Lac Z基因酵母細胞以篩選直接化學誘變物。方法:利用PCR方法從酵母基因組中擴增RNR3啟動子，將其插入到pMP206/ERE酵母報告載體，構建成RNR3調控的Lac Z酵母報告載體，將該載體轉入W30

4、3-1A酵母細胞，構建成RNR3調控的重組Lac Z基因酵母細胞。用數種化學誘變原作用于該重組基因酵母細胞，觀察其對RNR3的誘導表達，用Excel軟件進行分析。結果:放線菌素D、絲裂霉素C、阿非迪霉素和溴乙錠不能誘導RNR3的表達，而甲磺酸甲脂、瘤可寧、順鉑、4-硝基-N-氧化喹啉、博來霉素、福來霉素、5-氟尿嘧啶、喜樹堿和羥基脲誘變原與RNR3表達有明顯的劑量效應關系。結論:該重組酵母可用于對多種化學誘變原的快速篩選。
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5、.重組酵母細胞W303-1A/RN R3-LacZ/GP DV5-CYP1A1的構建及對間接誘變物的篩選
　　目的:建立由RNP3調控重組Lac Z基因及可表達CYP1A1基因的重組酵母細胞以篩選間接化學誘變物。方法:利用PCR方法從GV142質粒上擴增CYP1A1基因，將其插入到pGPDV5酵母表達載體上，構建成pGPDV5-CYP1A1酵母表達載體，將該載體轉入所建立的W303-1A/RNR3-Lac Z重組酵母細胞，構建成可

6、表達CYP1A1及受RNR3調控的LacZ基因酵母細胞。用Promega公司的試劑盒檢測CYP1A1表達，并用間接誘變原2-氨基芴作用于該重組基因酵母細胞，觀察其對RNR3的誘導表達，用Excel軟件進行分析。結果:DNA測序表明pGPDV5-CYP1A1酵母表達載體構建成功，并經PCR鑒定已經成功重組于酵母細胞，但經檢測發(fā)現(xiàn)CYP1A1活性較低，細胞經2-氨基芴作用后，與Lac Z表達無明顯時間劑量效應。結論:CYP1A1表達量不足，