AICAR誘導(dǎo)激活的AMPK在肝臟抑制TSH-SREBP-2-HMGCR通路.pdf

1、目的:
　　研究AMPK在肝臟中是否可通過(guò)SREBP-2在調(diào)節(jié)肝臟膽固醇代謝中起到積極作用，以及是否AMPK對(duì)TSH介導(dǎo)的SREBP-2的上調(diào)具有影響，這也許可為將來(lái)臨床治療與TSH相關(guān)的高膽固醇血癥提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外實(shí)驗(yàn):在HepG2細(xì)胞中，用AMPK激動(dòng)劑AICAR、TSH分別處理細(xì)胞，用SAMS試驗(yàn)檢測(cè)AMPK活性變化，觀察SREBP-2胞漿前體及核內(nèi)活性形式及其靶基因HMGCR、HMGCS的表

2、達(dá)變化。
　　2.體內(nèi)試驗(yàn):采用野生型(Tshr+/+)和TSH受體敲除（Tshr-/-）小鼠，AMPK激動(dòng)劑AICAR腹腔注射Tshr+/+和Tshr-/-小鼠，觀察胞漿及核內(nèi)成熟體SREBP-2及其靶基因HMGCR、HMGCS的表達(dá)變化。
　　3.用AMPK激動(dòng)劑AICAR處理HepG2細(xì)胞，2×Flag-SREBP-2質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)SREBP-2核內(nèi)活性形式，免疫沉淀SREBP-2、免疫印跡絲氨酸或蘇氨酸磷酸化抗體驗(yàn)

3、證AMPK可磷酸化SREBP-2核內(nèi)活性形式。
　　4.在AMPK激動(dòng)劑AICAR處理HepG2、L02細(xì)胞、Tshr-/-、Tshr+/+小鼠，肝細(xì)胞總蛋白免疫沉淀SREBP-2、免疫印跡絲氨酸或蘇氨酸磷酸化抗體驗(yàn)證AMPK可磷酸化SREBP-2胞漿前體形式。
　　5.雙重免疫熒光染色法驗(yàn)證TSH對(duì)AMPK磷酸化SREBP-2的抑制作用。
　　6.主要技術(shù):Real-Time PCR、免疫沉淀、免疫印跡、免疫熒光、質(zhì)

4、粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及建立小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷取?br>　　結(jié)果:
　　1.TSH在HepG2細(xì)胞上調(diào)SREBP-2蛋白水平和HMGCR、HMGCS的表達(dá)。
　　SREBP-2在肝臟優(yōu)先調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)膽固醇合成與吸收的靶基因如HMGCR、HMGCS，在給予TSH(4μM)處理HepG2細(xì)胞，SREBP-2前體及核內(nèi)活性形式被發(fā)現(xiàn)呈時(shí)間依賴方式增加。TSH處理后HMGCR的mRNA在24小時(shí)和48小時(shí)均上調(diào)，HMGCS的mRNA在48小時(shí)上調(diào)(p＜

5、0.05）。
　　2.HepG2細(xì)胞AICAR激活A(yù)MPK可直接抑制SREBP-2的表達(dá)。
　　SREBP-2可在多個(gè)水平被調(diào)控如固醇反饋機(jī)制或轉(zhuǎn)錄水平、翻譯后修飾等多個(gè)方面，曾有證據(jù)表明SREBP-2是AMPK的一個(gè)直接靶點(diǎn)，AMPK可直接抑制SREBP-2的轉(zhuǎn)錄活性。為了探討AMPK激活后是否對(duì)SREBP-2的前體和核內(nèi)形式具有調(diào)節(jié)作用，HepG2細(xì)胞給予AMPK的激動(dòng)劑AICAR處理12小時(shí)和24小時(shí)，作為AMPK激活

6、的標(biāo)志，磷酸化AMPK和磷酸化ACC水平明顯增加并且呈時(shí)間依賴性，SREBP-2前體在AICAR孵育12小時(shí)有一個(gè)輕度減少，而在處理24小時(shí)跟隨著出現(xiàn)一個(gè)明顯減少，但是SREBP-2的核內(nèi)形式在整個(gè)處理期間呈現(xiàn)一個(gè)明顯連續(xù)減少。
　　為證實(shí)這種變化，我們用實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)SREBP-2的mRNA水平，AICAR誘導(dǎo)激活的AMPK以時(shí)間依賴方式減少了SREBP-2的mRNA水平。在AICAR處理HepG2細(xì)胞，核內(nèi)SREBP-2的免疫

7、熒光強(qiáng)度明顯降低。
　　3.AICAR處理的Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠肝臟中，AMPK激活可減少SREBP-2蛋白及其靶基因表達(dá)。
　　早先曾有報(bào)道在甲狀腺及肝臟中TSH能夠抑制AMPK活性。為了進(jìn)一步研究TSH和AMPK對(duì)SREBP-2的影響，我們建立Tshr+/+ and Tshr-/-小鼠模型，與Tshr+/+小鼠相比，Tshr-/-小鼠肝臟中SREBP-2前體及核內(nèi)形式均減少了，盡管確切機(jī)制尚不清楚。

8、HMGCR的mRNA水平也明顯減少，HMGCS的mRNA呈現(xiàn)一個(gè)減少趨勢(shì)。
　　在PBS處理的Tshr-/-小鼠相較于Tshr+/+小鼠，小鼠肝臟中AMPK活性增加，而且，Tshr-/-小鼠肝臟中SREBP-2的前體及核內(nèi)蛋白均明顯減少。在AICAR處理的Ts hr-/-和Tshr+/+小鼠的肝臟，AMPK活性增強(qiáng)，SREBP-2蛋白水平降低。AICAR導(dǎo)致一個(gè)HMGCR mRNA明顯降低。
　　4.HepG2細(xì)胞AICAR

9、激活A(yù)MPK可抑制TSH誘導(dǎo)的SREBP-2的上調(diào)。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證TSH對(duì)AMPK活性的影響，在體外我們采用SAMS多肽磷酸化試驗(yàn)，HepG2細(xì)胞給予TSH處理后，AMPK活性明顯降低，而AICAR處理HepG2細(xì)胞后，AMPK活性明顯增強(qiáng)。下一步我們研究TSH誘導(dǎo)的SREBP-2上調(diào)是否通過(guò)AMPK激活，我們發(fā)現(xiàn)TSH誘導(dǎo)上調(diào)的SREBP-2的前體及核內(nèi)形式可被AICAR減輕。
　　為了明確AMPK激活抑制SREBP

10、-2后的功能結(jié)果，用實(shí)時(shí)PCR評(píng)價(jià)SREBP-2的靶蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平變化，同動(dòng)態(tài)變化的SREBP-2蛋白一致，在HepG2細(xì)胞中TSH刺激升高的HMGCR和HMGCS的mRNA水平被AICAR減弱。
　　5.在AICAR誘導(dǎo)AMPK激活的細(xì)胞及小鼠肝臟中，SREBP-2的蘇氨酸位點(diǎn)可被磷酸化。
　　AMPK作為一個(gè)進(jìn)化的保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝過(guò)程中具有重要作用，可磷酸化多種涉及脂肪酸氧化、膽固醇合成過(guò)程中間

11、酶激活或者抑制這些酶的活性。近來(lái)研究證實(shí)在HEK293細(xì)胞和LDLR敲除小鼠肝臟中，SREBP-2是AMPK的直接靶點(diǎn)。為了研究AMPK是否涉及到SREBP-2的磷酸化修飾，我們利用特異性蘇氨酸磷酸化抗體和絲氨酸磷酸化抗體，首先SREBP-2抗體免疫沉淀總蛋白，使用蘇氨酸磷酸化抗體和絲氨酸磷酸化抗體進(jìn)行免疫印跡分析，顯示SREBP-2的前體和核內(nèi)形式均有蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化，SREBP-2無(wú)絲氨酸位點(diǎn)磷酸化。我們已經(jīng)顯示在Tshr-/-小鼠

12、較Tshr+/+小鼠AMPK活性增強(qiáng)，同前述的結(jié)果一致，在Tshr-/-小鼠中內(nèi)源性SREBP-2前體蘇氨酸磷酸化的水平增加。在人肝L02細(xì)胞中也得到相似結(jié)果。
　　6.AMPK磷酸化SREBP-2，而TSH可抑制AMPK對(duì)SREBP-2的磷酸化。
　　結(jié)論:
　　1.AMPK在肝臟可抑制TSH介導(dǎo)的對(duì)SREBP-2及其靶基因HMGCR、HMGCS的上調(diào)作用。
　　2.AMPK可直接磷酸化SREBP-2前體及核內(nèi)