白藜蘆醇對離體人肺內(nèi)小動脈血管舒張作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究利用人的肺內(nèi)小動脈作為研究對象，觀察白藜蘆醇對離體人肺內(nèi)小動脈血管張力的影響及推測其舒張血管的作用機(jī)制。目前用于血管張力實(shí)驗(yàn)的血管主要有阻力血管和彈力血管，阻力血管舒縮狀態(tài)能夠影響血壓變化，本研究選取的直徑為1～1.5 mm的肺內(nèi)小動脈屬于阻力血管。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驗(yàn)榘邹继J醇的降壓作用提供實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)，從而對以后白藜蘆醇的臨床用藥有指導(dǎo)作用。
　　材料和方法：
　　1.標(biāo)本來源
　　本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源于201

2、4年5月8日～2014年7月28日在廣東省人民醫(yī)院因肺癌行肺葉切除手術(shù)的病人，年齡20～73歲，男22例，女13例。ASA分級Ⅰ～Ⅱ級，肺功能正常，排除高血壓、糖尿病、肺動脈高壓患者。均已告知患者標(biāo)本的用途，并均已簽署標(biāo)本的采集知情同意書。本研究已通過廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會倫理批準(zhǔn)（粵醫(yī)科倫理2010079H號）。取距離癌組織邊緣5 cm以上的正常肺組織作為本實(shí)驗(yàn)的研究標(biāo)本。
　　2.血管環(huán)的制備
　　選取距離癌組織5

3、 cm以上的正常肺組織，將肺組織放入裝有預(yù)冷(4℃)且混合氣(95％ O2+5％ CO2)飽和過的Kreb's液中，固定于硅膠板上，體視顯微鏡下仔細(xì)分離肺內(nèi)小動脈（直徑1～1.5 mm），制備成長度為1.5～2 mm的動脈環(huán)，用兩根直徑為40 um的鋼絲穿過管腔，固定于張力測定儀浴槽內(nèi)的兩個(gè)鉗夾上。平衡60 min，期間每隔15 min更換Kreb's液一次，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.8～2.0 mN。浴槽內(nèi)持續(xù)通入95％ O2+5％ CO2混

4、合氣，溫度恒定在37℃，以模擬人體內(nèi)環(huán)境。需要機(jī)械去內(nèi)皮的血管環(huán)時(shí)，不銹鋼絲來回摩擦血管管腔30次。
　　3.血管反應(yīng)性檢測
　　血管環(huán)平衡60 min后，將浴槽內(nèi)的Kreb's液更換成60 mmol/L高鉀溶液，高鉀溶液能夠使肺內(nèi)小動脈收縮，待張力穩(wěn)定到一平臺期，以Kreb's液充分洗凈(4次，每次間隔5 min)至張力恢復(fù)基線水平，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)兩次。前后兩次高鉀刺激后血管收縮幅度相差不超過10％進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　

5、　4.內(nèi)皮完整性檢測
　　高鉀檢測血管反應(yīng)性后平衡血管環(huán)30 min，加入5-HT2 umol/L收縮血管，待張力穩(wěn)定后加入Ach1 umol/L舒張血管，血管舒張大于60％視為內(nèi)皮完整，舒張小于10％視為內(nèi)皮不完整。Kreb's液充分洗凈，張力恢復(fù)至基線水平30 min后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　5.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
　　5.1 白藜蘆醇對靜息狀態(tài)下血管張力的影響
　　5.2 白藜蘆醇對U46619、內(nèi)皮素-1、氯化鉀預(yù)收

6、縮的肺內(nèi)小動脈的影響
　　5.3 白藜蘆醇對預(yù)收縮內(nèi)皮完整和機(jī)械去內(nèi)皮的人肺內(nèi)小動脈舒張效應(yīng)
　　5.4 NO合酶抑制劑L-NAME孵育后對白藜蘆醇舒張血管效應(yīng)的影響
　　5.5 吲哚美辛孵育后對白藜蘆醇舒張血管效應(yīng)的影響
　　5.6 K+通道阻滯劑對白藜蘆醇舒張作用的影響
　　5.7 Ca2+通道對白藜蘆醇舒張作用的影響
　　6.數(shù)據(jù)測定及統(tǒng)計(jì)處理
　　以加入收縮劑預(yù)收縮最大收縮幅度為100％

7、，加入白藜蘆醇后血管舒張與最大收縮幅度的比值的百分比反應(yīng)血管張力的變化，EC50表示產(chǎn)生50％最大舒張效應(yīng)時(shí)的藥物濃度，pD2為產(chǎn)生最大效應(yīng)的50％時(shí)激動劑摩爾濃度的負(fù)對數(shù)，pD2=-lg(EC50)，最大舒張作用的變化值為Emax。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS13.0，采用Prism5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，繪制舒張曲線。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.

8、白藜蘆醇對靜息狀態(tài)下血管張力的影響
　　累積濃度白藜蘆醇(10、30、100、300、1000 umol/L)對靜息狀態(tài)下內(nèi)皮完整人肺內(nèi)小動脈血管環(huán)張力無影響。
　　2.白藜蘆醇對U46619、內(nèi)皮素-1、氯化鉀預(yù)收縮的肺內(nèi)小動脈的影響
　　累積濃度的白藜蘆醇對U46619、ET-1、60 mmol/L KCl預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)有舒張作用，并呈濃度依賴性，其pD2分別為3.82±0.20，3.84±0.57，3.6

9、8±0.27，Emax分別為(99.58±0.83)％，100％，(99.65±0.98)％，溶劑對照組無明顯的舒張作用。
　　3.白藜蘆醇對用100 umol/L L-NAME孵育血管環(huán)張力的影響
　　累積濃度的白藜蘆醇對用100 umol/L L-NAME孵育30 min的血管環(huán)有舒張作用，并呈濃度依賴性，pD2為3.64±0.10，Emax為(98.97±2.30)％，且在100 umol/L時(shí)，同未加L-NAME孵育

10、的血管環(huán)比較，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，L-NAME可能導(dǎo)致白藜蘆醇舒張作用右移，說明白藜蘆醇的舒張作用可能與促進(jìn)內(nèi)皮的NO釋放有關(guān)。
　　4.白藜蘆醇對用10 uM/L吲哚美辛孵育血管環(huán)張力的影響
　　累積濃度的白藜蘆醇對用10 uM/L吲哚美辛孵育30 min的血管環(huán)有舒張作用，并呈濃度依賴性，pD2為3.91±0.31，Emax為100％，兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明白藜蘆醇的舒張作用可能與環(huán)氧合酶無關(guān)。
　　5.

11、白藜蘆醇對機(jī)械去內(nèi)皮血管環(huán)的影響
　　累積濃度的白藜蘆醇對機(jī)械去內(nèi)皮的血管環(huán)有舒張作用，并呈濃度依賴性，pD2為4.04±0.05，Emax為100％，說明白藜蘆醇舒張作用不依賴于內(nèi)皮。
　　6.K+通道阻滯劑對白藜蘆醇舒張作用的影響
　　內(nèi)皮完整的血管環(huán)，使用格列本脲（ATP敏感的K+通道阻滯劑）、BaCl2(內(nèi)向整流K+通道阻滯劑)、TEA+(大電導(dǎo)Ca2+激活K+通道阻滯劑)預(yù)孵育后，累積加入白藜蘆醇對血管環(huán)有舒

12、張作用，并呈濃度依賴性，pD2分別為4.04±0.04、3.77±0.07、3.92±0.1，Emax分別為(100±6.81)％、(100±5.98)％、(100±7.18)％，說明白藜蘆醇的舒張作用不依賴于K+通道。
　　7.Ca2+通道對白藜蘆醇舒張作用的影響
　　7.1 硝苯地平對白藜蘆醇舒血管效應(yīng)的影響
　　選取去內(nèi)皮的血管環(huán)，加入L型VGCC阻斷劑硝苯地平(100nM/L)預(yù)孵育，U46619收縮血管，累計(jì)

13、加入白藜蘆醇后對肺內(nèi)小動脈仍然有舒張作用，并呈濃度依賴性，pD2為3.92±0.06，Emax為(99.25±2.6)％，在100 umol/L時(shí)兩者有差異性，說明白藜蘆醇舒張作用可能與L型VOCC有關(guān)。
　　7.2 TXA2受體相關(guān)ROCC對白藜蘆醇舒張血管的影響
　　機(jī)械去內(nèi)皮的血管環(huán)，加入硝苯地平預(yù)孵育，對不同血管分別加入10umol/L、30 umol/L、100 umol/L的白藜蘆醇孵育30 min，然后累積加入

14、U46619（10-9～10-6）后血管發(fā)生收縮反應(yīng)，但能部分抑制U46619引起的收縮反應(yīng)，呈濃度依賴性，提示白藜蘆醇的舒張血管活性可能與TXA2受體相關(guān)ROCC有關(guān)。
　　7.3 內(nèi)鈣釋放對白藜蘆醇舒張血管的影響
　　去內(nèi)皮血管環(huán)于無Ca2+的Krebs液中，硝苯地平存在的條件下，不同濃度白藜蘆醇及二甲亞砜孵育，白藜蘆醇能抑制U46619引起的血管環(huán)收縮反應(yīng)，表明白藜蘆醇的舒張血管效應(yīng)可能與內(nèi)鈣釋放有關(guān)。
　　結(jié)論