小動(dòng)脈血栓MRI免疫成像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 一、嘗試以雙功能螯合劑cDTPA連接Gd和D-二聚體抗體制備血栓MR靶向?qū)Ρ葎?。為了檢測(cè)合成的血栓MR靶向?qū)Ρ葎┑募兌?、穩(wěn)定性等性質(zhì)及其在活體內(nèi)的生物分布情況,我們首先采用傳統(tǒng)的放射免疫技術(shù),采用相似的方法以cDTPA連接99mTc和D-二聚體抗體,觀察抗體在血栓模型體內(nèi)的分布情況,并行ECT小動(dòng)脈血栓靶向成像,比較兩種靶向顯像在小動(dòng)脈血栓方面的成像效果；
　　 二、嘗試建立制作方法簡(jiǎn)單、成功率高、重復(fù)性好

2、,形成體積較大并穩(wěn)定的小動(dòng)脈血栓模型；
　　 三、將Gd標(biāo)記抗D-二聚體單克隆抗體注入大鼠體內(nèi),于多個(gè)時(shí)間點(diǎn)行大鼠股動(dòng)脈血栓MR顯像,與注射Gd-DTPA的大鼠股動(dòng)脈血栓MR顯像效果比較,探討前者在小動(dòng)脈血栓定位診斷中的作用,并探討其潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 材料和方法：
　　 (一)99mTc-DTPA-鼠抗人D-二聚體抗體的制備及檢測(cè)
　　 1.1 抗體的制備及標(biāo)記將純化的鼠抗人D-二聚體抗體置于碳酸氫鹽

3、緩沖液中,4℃透析過夜,并用該緩沖液調(diào)節(jié)抗體濃度至1mg/ml。cDTPA溶于無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中,密閉置于干燥劑中保存。按cDTPA與抗體的摩爾比為30:1在pH8.2緩沖液中進(jìn)行反應(yīng),乙酸終止反應(yīng)。按1μCi/μg抗體投入高锝酸鹽,pH6.0醋酸鹽緩沖液中作用30min,新華Ⅰ號(hào)濾紙層析展開,展開液為:丙酮與EDTA(6mmol/L),二者體積比為2:1,GC-911型NaI晶體γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定cpm,計(jì)算標(biāo)記率。
　　

4、1.2 放化純度、比活度、穩(wěn)定性測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)物用GE Healthcare Sephadex G25層析柱純化去除游離的DTPA和99mTc,紙層析法測(cè)定放化純度,同時(shí)用Beckman334型(TSK3000)高效液相色譜儀驗(yàn)證。蛋白濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定,并根據(jù)標(biāo)記產(chǎn)物放射性計(jì)算比活度。取純化產(chǎn)品500μl加入等體積的大鼠血清,分別在0、3、6、12、24h取樣紙層析展開,分析解離率。
　　 1.3 免疫活性測(cè)定首先用裂解液裂

5、解大鼠全血,離心提取其中的蛋白,置于10％聚丙烯胺凝膠上電泳,(已知D-二聚體分子量為62 KDa),再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移后NC膜上。將NC膜用TBS溶液浸潤(rùn)后,放于盛有封閉液的平皿中,于搖床上20℃,80r/min封閉2h。將一抗于不同通道上與膜蛋白孵育1～2h,用TBS封閉NC膜再用標(biāo)記前標(biāo)記后的抗體在不同通道上與抗原(D-二聚體)特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,將一抗孵育后的NC膜置于TBST緩沖液中,于搖床上20℃,80r/min

6、清洗兩次,每次10min。然后再用TBS緩沖液洗一次,10min。清洗除去未結(jié)合的抗體和蛋白,NC膜上就只有結(jié)合著抗體的D-二聚體。用HRP標(biāo)記的羊抗大鼠二抗與抗體結(jié)合,再用底物酶催化顯色產(chǎn)生可見的區(qū)帶,比較標(biāo)記前的抗體與標(biāo)記后的抗體產(chǎn)生的區(qū)帶,觀察區(qū)帶是否有差異。
　　 (二)Gd—DTPA-鼠抗人D-二聚體抗體的制備及檢測(cè)2.1抗體的制備將純化的鼠抗人D-二聚體抗體置于碳酸氫鹽緩沖液中,4℃透析過夜,并用該緩沖液調(diào)節(jié)抗體濃度

7、至1mg/ml。cDTPA溶于無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中,密閉置于干燥劑中保存。按cDTPA與抗體的摩爾比為30:1在pH8.2緩沖液中進(jìn)行反應(yīng),乙酸終止反應(yīng)。按方法1.1的摩爾數(shù)投入GdCl3,過層析柱去除游離的Gd3+和DTPA純化。
　　 (三)大鼠股動(dòng)脈血栓模型成像研究
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常SPF級(jí)Wistar大鼠18只,由南方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,雌雄不限,體重300—500g。
　　 2.模型的建立

8、
　　 2.1 大鼠血栓模型的建立:實(shí)驗(yàn)Wistar大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉,在腹股溝區(qū)剪開皮膚,分離皮下組織,找到并游離股動(dòng)脈,以血管夾夾閉股動(dòng)脈近心段,在距離鉗夾位置約1cm處用微量注射器抽出該段血液,再注入約20μl的凝血酶,這時(shí)再用一血管夾夾閉注射位置的遠(yuǎn)心端,兩個(gè)血管夾維持70—163min,確保血栓穩(wěn)定不易游走,脫落。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)點(diǎn)為3h,可觀察都被鉗夾的血管段顏色變暗,同側(cè)肢體遠(yuǎn)端皮膚溫度降低,皮膚由紅潤(rùn)變?yōu)榘底?/p>

9、色,動(dòng)脈搏動(dòng)消失。提示血栓已形成,松開血管鉗后,用肝素生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)殘留的血液,并用紗布或棉球吸干,縫合切口。喂養(yǎng)4天后,隨機(jī)處死3只大鼠,大體病理及鏡下病理觀察是否有血栓形成。
　　 2.2 采用隨機(jī)數(shù)字法將已建成股動(dòng)脈模型的大鼠其分為三組:1、核素掃描組5只,抗體劑量0.01μmol/g2、MR掃描組10只:抗體劑量0.0lμmol/g,Gd—DTPA劑量0.17μmol/g。
　　 3.核素掃描方法將99mTC-

10、DTPA-鼠抗人D-二聚體抗體以單抗劑量為20μg/kg注射已建成股動(dòng)脈血栓的大鼠模型,99mTC注射的比活性為14.8MBq/kg,分別于注射后5min、30min、1h、3h和6h用SPET顯像,觀察其現(xiàn)象。檢測(cè)后處死動(dòng)物,取股動(dòng)脈血栓和心、肝、脾、肺、腎、膀胱分別測(cè)出放射性含量。計(jì)算各個(gè)組織器官單位重量組織器官的放射性計(jì)數(shù)占注入劑量的百分?jǐn)?shù)。
　　 4.MR掃描方法MRI掃描(GE Signa EXCITE HD)3.0T

11、MR超導(dǎo)型磁共振掃描儀)采用軟線圈,橫斷面掃描,掃描參數(shù)為FSE T1WI(TR/TE=400ms/7.5ms)。增強(qiáng)后加做壓脂序列。10只形成股動(dòng)脈血栓的大鼠分為2組,其中經(jīng)尾靜脈注射Gd-DTPA-鼠抗人D-二聚體抗體5只,Gd-DTPA對(duì)照組5只。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行MR掃描,測(cè)量SET1WI平掃及增強(qiáng)后5min、10min、30min、60min圖像內(nèi)血栓信號(hào)強(qiáng)度并計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度比,繪制時(shí)間信號(hào)強(qiáng)度比曲線。
　　 5.圖像分析

12、r>　　 5.1 觀察血栓部位于ECT圖像上顯示的亮度,并進(jìn)行計(jì)數(shù),測(cè)出大小。
　　 5.2 測(cè)量MR圖像上2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)T1WI像上血栓信號(hào)強(qiáng)度及對(duì)側(cè)股動(dòng)脈信號(hào)強(qiáng)度,在背景區(qū)域選取較大的ROI,測(cè)背景噪聲的標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)算血栓及對(duì)側(cè)股動(dòng)脈各時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度比。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,使用SPSS16.0軟件包
　　 6.1 采用單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析,對(duì)血栓和心、肝、脾、肺、腎、血液的單位重量組織器官放

13、射性計(jì)數(shù)占注入劑量百分?jǐn)?shù)做多重比較進(jìn)行分析(P<0.05)。
　　 6.2 采用單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析,2組MR對(duì)比劑血栓部位和對(duì)側(cè)股動(dòng)脈于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度比(P<0.05)。
　　 結(jié)果：
　　 1.計(jì)算出99mTc標(biāo)記抗體的標(biāo)記率為82％,放射化學(xué)純度92％,比活度為0.8mCi/mg,6h后測(cè)定的解離率為8％。
　　 2.Gd和99mTc標(biāo)記后的抗體均具有免疫活性。
　　 3.肉眼大

14、體病理實(shí)驗(yàn)段血管可以明顯看到血管內(nèi)紅色的血栓,而正常的血管是透明的,光鏡下的觀察結(jié)果股動(dòng)脈管腔內(nèi)可見呈粉染半透明分枝狀的血小板小梁和網(wǎng)狀排列的纖維素,纖維網(wǎng)眼中可見大量紅細(xì)胞等混合血栓成分。
　　 4.注射99mTc-DTPA-D-二聚體抗體后,5只大鼠的股動(dòng)脈血栓其單位重量組織器官的放射性計(jì)數(shù)占注入劑量的百分?jǐn)?shù)(0.105)僅低于腎臟(0.797)而高于血液(0.015)；血栓部位聚集的99mTc-DTPA-D-二聚體抗體是特

15、異性聚集,因其高于血液本底。
　　 5.大鼠尾靜脈注射Gd-DTPA后,其股動(dòng)脈血栓信號(hào)強(qiáng)度比于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異(P=0.056),即無(wú)明顯強(qiáng)化；且與對(duì)側(cè)股動(dòng)脈于5min,10min及60min時(shí)間點(diǎn)上有差異,在這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均數(shù)均低于對(duì)側(cè)股動(dòng)脈。大鼠尾靜脈注射Gd-DTPA-鼠抗人D-二聚體抗體后,其股動(dòng)脈血栓信號(hào)強(qiáng)度比于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)有明顯差異(P=0.005),即有強(qiáng)化,且在10min點(diǎn)上血栓信號(hào)強(qiáng)度比的均數(shù)最高,這與MR

16、圖像在10min的點(diǎn)顯像最佳相符。在10min與30min這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)血栓信號(hào)強(qiáng)度比的均數(shù)均高于對(duì)側(cè)股動(dòng)脈。
　　 6.注射99mTc-DTPA-D-二聚體抗體后,5只大鼠ECT圖像上各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未顯示股動(dòng)脈血栓核素的特異性濃聚。
　　 7.大鼠尾靜脈注射Gd-DTPA-D-二聚體抗體組,有4例確定有股動(dòng)脈血栓,1例可疑有股動(dòng)脈血栓；注射Gd-DTPA組,有2例確定有股動(dòng)脈血栓,3例可疑有股動(dòng)脈血栓；注射99mTc—DT

17、PA-D-二聚體抗體組,5例均未見股動(dòng)脈血栓顯示,病理解剖結(jié)果顯示每組5只大鼠股動(dòng)脈均有血栓形成。
　　 結(jié)論：
　　 (1)99mTc-DTPA-D-二聚體抗體有比較高的純度、穩(wěn)定性,并具有免疫活性。
　　 (2)用相似方法制備的Gd-DTPA-D-二聚體抗體具有免疫活性,也應(yīng)具有較高的純度和穩(wěn)定性,為后續(xù)的免疫成像打下基礎(chǔ)。
　　 (3)本實(shí)驗(yàn)選擇的建立大鼠股動(dòng)脈血栓模型方法成功率高,為下一部分大鼠股