人水離子通道蛋白4的表達及在視神經(jīng)脊髓炎診斷中的應用.pdf

1、背景：
　　視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica,NMO）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central
　　nervous system,CNS)的嚴重性脫髓鞘疾病，主要損傷視神經(jīng)和脊髓，多起病急驟且進展迅速，嚴重危害人類的健康。自1894年NMO這一概念被提出以來，對于NMO是一獨立的疾病還是多發(fā)性硬化(mutiple sclerosis,MS)的亞型一直存在較大的爭議。2004年Lennon等發(fā)現(xiàn)抗水離子通道蛋白4(

2、aquaporin-4,AQP4)抗體是NMO的特異性致病抗體，從而證明了NMO是不同于MS的一種體液免疫介導的自身免疫性疾病。由于NMO和MS的治療和預后存在較大的差異，因此，檢測疑似病例血清中的抗AQP4抗體水平對于NMO和MS的鑒別診斷、治療及預后判斷具有明顯的指導意義。迄今為止國內(nèi)尚缺乏靈敏度高和特異性強的試劑盒用于檢測AQP4抗體，建立一種適用于國人NMO中自身抗體的檢測方法是非常有必要的。目前已經(jīng)證明該抗體的主要結(jié)合位點是其

3、靶抗原AQP4的胞外區(qū)，克隆表達AQP4的胞外區(qū)有望為抗AQP4抗體的檢測提供原料。另外通過真核表達系統(tǒng)表達AQP4全長蛋白，比較原核表達胞外區(qū)蛋白和真核表達全長蛋白在檢測AQP4抗體中的差異。
　　目的：
　　1.通過構建pET32a(+)-AQP4的胞外區(qū)的原核表達質(zhì)粒，表達AQP4的胞外區(qū)蛋白，建立一種可用于檢測AQP4抗體的ELISA方法。
　　2.利用重組質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP-AQP4轉(zhuǎn)染HEK293

4、細胞，表達AQP4全長蛋白，建立用于檢測抗AQP4抗體的CBA方法。
　　方法：
　　1.利用生物信息學軟件TMHMM2.0分析人AQP4的結(jié)構，并根據(jù)大腸桿菌的密碼子的偏好性設計合成AQP4胞外區(qū)的寡核苷酸序列。
　　2.利用分子克隆技術構建pET32a(+)-AQP4胞外區(qū)的原核表達質(zhì)粒。
　　3.構建的重組表達質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，利用IPTG進行誘導表達蛋白，然后通過SDS-PAGE

5、電泳分析表達產(chǎn)物。
　　4.大規(guī)模培養(yǎng)宿主菌并誘導表達目的蛋白，利用Ni2+離子親和層析技術進行蛋白質(zhì)的純化，目的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Western blot的鑒定。
　　5.利用純化酶切的目的蛋白包被 ELISA微孔板，通過國際公認檢測AQP4抗體的金標準間接免疫熒光法篩選的陽性血清對表達蛋白的生物活性進行評估。
　　6.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術將重組質(zhì)粒 pCMV6-AC-GFP-AQP4轉(zhuǎn)染HEK293細胞，

6、并同時用pCMV6-AC-GFP轉(zhuǎn)染細胞作為對照。對轉(zhuǎn)染細胞進行固定后進行后通過間接免疫熒光法檢測NMO患者患者血清中的抗體。
　　結(jié)果：
　　1.限制性內(nèi)切酶和測序分析均鑒定重組表達質(zhì)粒構建正確。
　　2.經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒定，構建的pET-32a(+)-AQP4胞外區(qū)的原核表達質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)誘導表達的蛋白可以可溶性的表達形式在菌體的上清中表達，其相對分子量均在26KD左右。
　　3.誘導表達的蛋白均可

7、經(jīng)過一步親和層析達到較高的純度。
　　4.誘導表達的蛋白均可與抗His-tag的抗體進行特異性的結(jié)合。
　　5.表達的AQP4的胞外區(qū)不能與抗AQP4抗體特異性結(jié)合。
　　6.轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒的細胞綠色熒光充滿整個細胞，而轉(zhuǎn)染GFP-AQP4的細胞綠色熒光僅定位于細胞膜。
　　7.轉(zhuǎn)染GFP-AQP4的細胞能與NMO患者血清中的抗AQP4抗體特異性結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1.成功構建了pET-32a(