KGN聯(lián)合純富血小板血漿促進(jìn)腱骨愈合和纖維軟骨再生的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 驗證KGN促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化的能力
　　目的:體外實驗驗證KGN促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向軟骨分化的能力，檢驗體內(nèi)應(yīng)用KGN促進(jìn)腱骨愈合研究的可行性，為隨后實驗提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:采用膠原酶和中性酶消化法獲取原代肌腱干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用單細(xì)胞培養(yǎng)法提純肌腱干細(xì)胞。然后通過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物以鑒定所提取細(xì)胞是否是肌腱干細(xì)胞。然采用不同濃度的KGN處理肌

2、腱干細(xì)胞;使用CCK-8方法檢測KGN對于肌腱干細(xì)胞的促增殖效應(yīng);使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測KGN對于肌腱干細(xì)胞的促分化效應(yīng)。
　　結(jié)果:采用膠原酶和中性酶消化法以及單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，并經(jīng)過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果表明以上方法可以獲取純度較高的原代肌腱干細(xì)胞。通過CCK-8方法檢測的增殖實驗結(jié)果表明不同KGN濃度（1nM，10nM，100nM，1μM，10μM）的實驗組中細(xì)胞增殖速度并未見明顯差異，并且與空白對照組無明顯差

3、異，這表明KGN對肌腱干細(xì)胞的促增殖能力不明顯。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測不同濃度KGN處理后肌腱干細(xì)胞中軟骨分化相關(guān)的三個標(biāo)志物(Col-2，Sox-9和Aggrecan)均有不同程度的升高，而且升高程度與KGN濃度正相關(guān)，這也表明KGN促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化能力突出。
　　結(jié)論:我們采用的肌腱干細(xì)胞提取和鑒定方法較為成熟，可以獲取純度較高的肌腱干細(xì)胞。KGN無明顯促進(jìn)肌腱干細(xì)胞增殖的能力，但KGN誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞成軟骨分

4、化作用明顯。通過對于KGN的體外實驗研究和驗證結(jié)果表明KGN對于肌腱干細(xì)胞的作用符合我們預(yù)期，適合應(yīng)用于腱骨愈合的體內(nèi)實驗研究，因而可將KGN用于下一步的體內(nèi)實驗。
　　第二部分 L-PRP與P-PRP對肌腱干細(xì)胞的不同細(xì)胞學(xué)作用
　　目的:以肌腱干細(xì)胞作為細(xì)胞研究對象，研究兩種不同的富血小板血漿血漿(P-PRP(純富血小板血漿)和L-PRP（富含白細(xì)胞血小板血漿））對肌腱干細(xì)胞的合成，分解代謝水平以及炎癥反應(yīng)的同作用，最終

5、獲得L-PRP與P-PRP的不同細(xì)胞學(xué)作用，并選出其中更有利于組織修復(fù)的一種PRP用于隨后的動物實驗;聯(lián)合KGN并作為其載體應(yīng)用于腱骨愈合的實驗研究中。
　　方法:使用高速短時間的二次離心法獲取P-PRP和L-PRP，將獲得的兩種PRP調(diào)整至相同的血小板濃度。采用與第一部分相同的方法制取和鑒定肌腱干細(xì)胞。使用Transwell系統(tǒng)對肌腱干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，細(xì)胞置于下層，P-PRP或L-PRP放入上層。使用CCK-8進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗

6、檢測L-PRP和P-PRP在2％，5％，10％和20％四種不同濃度下對肌腱干細(xì)胞的增殖作用。另一部分細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)14天，通過光鏡不斷監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞通過RT-PCR、Western Blot、細(xì)胞免疫熒光染色以及ELISA等手段檢測不同處理后細(xì)胞的合成代謝、分解代謝以及炎癥狀態(tài)。
　　結(jié)果:我們采用的PRP制取方法可以穩(wěn)定的獲取3倍濃度的P-PRP和L-PRP。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明P-PRP和L-PRP均可

7、明顯促進(jìn)肌腱干細(xì)胞增殖，并且與劑量相關(guān)，在10％的濃度時促增殖效果最佳，而濃度若繼續(xù)升高促增殖能力逐漸下降。兩種PRP均可誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞成肌腱細(xì)胞分化并能激活肌腱細(xì)胞。但是兩種PRP在很多效果上還存在差異。L-PRP可促進(jìn)肌腱干細(xì)胞處于更高的分解代謝和炎癥狀態(tài);它的作用可以提高分解代謝相關(guān)因子MMP-1和MMP-13以及炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2的表達(dá)。想法P-PRP這主要提高合成代謝相關(guān)因子的表達(dá)比如COL-1

8、，COL-3以及α-SMA。
　　結(jié)論:這些結(jié)果表明L-PRP與P-PRP的細(xì)胞學(xué)作用的確存在差異。因此PRP類型的不同（特別是是否富含白細(xì)胞）很可能是影響PRP療效導(dǎo)致臨床結(jié)果不一致的關(guān)鍵因素。由于腱骨愈合的關(guān)鍵是促進(jìn)纖維軟骨組織的修復(fù)和再生，因此我們選擇促進(jìn)組織愈合再生方面能力更優(yōu)的P-PRP作為KGN的載體，應(yīng)用于隨后的動物實驗中，檢測KGN聯(lián)合P-PRP促進(jìn)腱骨愈合的效果。
　　第三部分 KGN聯(lián)合P-PRP促進(jìn)腱骨

9、愈合和纖維軟骨再生的體內(nèi)
　　目的:探討KGN聯(lián)合P-PRP膠對纖維軟骨再生以及腱骨連接愈合的作用。
　　方法:按照第二部分方法制取P-PRP，再與KGN粉末按照預(yù)先設(shè)計的濃度進(jìn)行混合。采用HPLC（高效液相色譜法）檢測KGN在P-PRP膠中的釋放情況。建立大鼠腱骨隧道愈合模型。體內(nèi)實驗總共51只大鼠，隨機(jī)分為三組進(jìn)行處理:組1向骨隧道中同時注射KGN+PRP混合液50μl+牛凝血酶5μl;組2向骨隧道中注射PRP混合液50

10、μl+牛凝血酶5μl;組3向骨隧道中注射生理鹽水50μl+牛凝血酶5μl。同時組2與組3的溶液中含有與組1溶液中相同濃度的二甲亞砜。于術(shù)后第4周，8周，12周取組織標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)檢測（H&E，Safranin O+Fastgreen，IHC，IF），每次每組3只。于第8周獲取標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)檢測，每組8只。
　　結(jié)果:KGN在PRP膠中的釋放實驗表明KGN釋放可持續(xù)4天，在最開始的4小時釋放速度最快，4-48小時釋放速度逐漸下降直

11、至平臺期。H&E和SafraninO+Fastgreen染色結(jié)果表明KGN聯(lián)合PRP膠可以明顯促進(jìn)腱骨連接處的軟骨生成，免疫染色結(jié)果顯示再生的軟骨高表達(dá)Col-1和Col-2，說明再生軟骨為纖維軟骨。生物力學(xué)實驗結(jié)果也表明KGN聯(lián)合PRP膠組可以明顯提升腱骨連接處的機(jī)械性能。并且我們還發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用PRP膠并不能有效的促進(jìn)腱骨界面的軟骨再生。
　　結(jié)論:KGN聯(lián)合PRP凝膠可誘導(dǎo)腱骨連接界面的纖維軟骨再生進(jìn)而促進(jìn)腱骨隧道愈合;單獨施