小鼠MT-αα基因轉(zhuǎn)入水生美人蕉的研究.pdf

1、美人蕉生長(zhǎng)強(qiáng)健，生態(tài)幅度廣，我國(guó)南北各地都能適應(yīng)，從熱帶、亞熱帶至溫帶地區(qū)均有栽培。哺乳動(dòng)物的金屬硫蛋白(Metallothionein，簡(jiǎn)稱(chēng)MT)是一類(lèi)低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，在動(dòng)物體內(nèi)主要參與必需金屬離子的代謝和有毒重金屬的解毒等過(guò)程。小鼠MY-I具有α和β兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)和功能上既相互聯(lián)系又各有分工，并且對(duì)重金屬具有不同的親和力，其中a結(jié)構(gòu)域優(yōu)先結(jié)合cd2+、Hg2+等，而β結(jié)構(gòu)域優(yōu)先結(jié)合cu2+、zn

2、2+等。 本研究以水生美人蕉為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，開(kāi)展了小鼠金屬硫蛋白基因(MT)及其突變體αα基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，利用它們結(jié)合并解毒重金屬的特性，提高美人蕉對(duì)Cd等重金屬的抗性和積累能力，從而開(kāi)發(fā)出新型植物，用于環(huán)境重金屬污染的生態(tài)修復(fù)。 無(wú)菌苗的制備：以取回的野外水生美人蕉為材料，清洗干凈，后用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗20min左右，切取長(zhǎng)為1-2cm的芽苞，在無(wú)菌環(huán)境下用75％的乙醇浸30秒，再用0.1％HgCl2處理

3、10min左右，無(wú)菌水沖洗4-6次后，切取5mm3左右?guī)в?-4個(gè)葉原基的莖尖作為外植體，一接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上。 組織培養(yǎng)：以水生美人蕉為試材，將水生美人蕉不同的外植體接種于不同基本培養(yǎng)基和添加不同激素種類(lèi)及其濃度配比的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，研究叢生芽及愈傷組織的誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明：莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)和花梗為適宜的組培器官；莖尖成苗率最高的激素組合是NAA0.1mg/L與6-BA2.0mg/L和3.0mg/L；苗平均高度最高的培養(yǎng)基配方是6-

4、BA 2.0mg/L、3.0mg/L與NAA0.5mg/L，的組合；美人蕉不定芽增殖最優(yōu)培養(yǎng)基為．MS4+6-BA 8mg/L+NAA 0.1mg/L。 遺傳轉(zhuǎn)化中選擇壓力的確定：本研究構(gòu)建的植物表達(dá)載體以抗除草劑抗性(bar)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt-Ⅱ)基因?yàn)闃?biāo)記基因，因此可用PPT和Kan作為轉(zhuǎn)化植株的篩選壓力。本實(shí)驗(yàn)對(duì)美人蕉的卡那霉素抗性作了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)隨著Kan濃度的提高，子葉白化率升高、根莖變短、鮮重減輕

5、。在30 mg/L的處理中，生長(zhǎng)20天的白化苗率達(dá)到100％。美人蕉的卡那霉素抗性檢測(cè)為遺傳轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性后代篩選奠定了基礎(chǔ)。 遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化：以水生美人蕉生長(zhǎng)點(diǎn)為材料，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水生美人蕉生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化體系的幾個(gè)因素。得出最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件是：菌液濃度OD600=0.3-0.5左右；菌液中加入100μmol/L AS，浸染時(shí)間10-15min，共培養(yǎng)3天。 通過(guò)農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)