新化學結構真菌次級代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性篩選及作用研究.pdf

1、目的:多硫代二酮哌嗪(ETP)類化合物是由真菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，其結構新穎、立體化學結構獨特、骨架類型多樣，因此ETP類化合物的生物活性研究一直備受關注。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)ETP具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌以及免疫抑制等作用[28-32]。ETP類化合物的抗腫瘤效應顯示出一定的靶向性，如可以通過激活p53信號通路誘導細胞周期發(fā)生G2/M期阻斷[37]、抑制酪氨酸激酶活性[38]以及抑制腫瘤組織新生血管的形成[39]。本所研究人員在真菌中提取

2、到八種新化學結構的ETP類真菌次級代謝產(chǎn)物(C80、C86、C87、662、DR56-1、DR56-52、zw-2、DS56-10)，其抗腫瘤活性有待檢驗。本研究擬在細胞水平進行抗腫瘤活性的初步篩選，在此基礎上對活性較好的化合物進行體內(nèi)外抗腫瘤作用評價，并同時開展活性化合物抗腫瘤作用機制的研究。
　　方法:(1)以磺酰羅丹明B(SRB)法觀察ETP類化合物對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞存活率的影響，并計算50％生長抑制濃度(GI50)。(2

3、)在裸鼠異種移植瘤模型上評價化合物C87的體內(nèi)抗腫瘤作用。(3)建立以實時細胞分析(RTCA)系統(tǒng)實時監(jiān)測腫瘤細胞生長情況的方法，評價化合物C87對腫瘤細胞生長增殖的影響。(4)以流式細胞術檢測C87對細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生、細胞周期、線粒體膜電位、以及對細胞凋亡的影響。(5)通過用比色法檢測帶有生物素標簽的AP位點來評價C87對DNA損傷的影響。(6)采用Western Blot方法檢測C87對腫瘤細胞內(nèi)凋亡相關分子蛋白表達水平的影響。

4、r>　　結果:(1)本研究首先在HeLa、HCT116、SMMC7721、A549、H460、H1993、H157、MDA-MB-231等多種腫瘤細胞系上，評價了八種新化學結構的真菌次級代謝產(chǎn)物(C80、C86、C87、662、DR56-1、DR56-52、zw-2、DS56-10)對細胞生長增殖的影響，發(fā)現(xiàn)ETP類化合物C80、C86、C87對上述幾種細胞系均具有不同程度的細胞生長抑制活性，其他五種化合物則作用不明顯。(2)以化合物C

5、87為主要研究對象，結果顯示C87能抑制多種腫瘤細胞增殖，具有濃度及時間依賴性;并且能夠一定程度地抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長增殖，抑瘤率為33.22％。(3)化合物C87可時間及濃度依賴性地誘導腫瘤細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。伴隨給予抗氧化劑NAC后能明顯抑制C87引起的細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，并且NAC可以明顯逆轉C87引起的細胞生長抑制作用。(4)化合物C87可以濃度依賴性誘導細胞周期G0/G1期阻滯，上調p53蛋白表達。(5)化合物C87可以濃度依

6、賴性誘導細胞線粒體膜電位下降。(6)化合物C87可以誘導細胞凋亡，具有濃度及時間依賴性，伴隨給予抗氧化劑NAC后能明顯抑制C87引起的細胞凋亡。(7)化合物C87可以誘導細胞色素C釋放，啟動Caspase-8，使Caspase-3活化，促進PARP裂化。
　　結論:從八種新化學結構的化合物中篩選出抗腫瘤作用明顯的三個ETP類化合物C80、C86、C87，因其母核結構相同且作用效果相當，因此以C87為主要研究對象，發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細

7、胞的生長具有抑制作用，呈濃度及時間依賴性。其抗腫瘤作用機制可能有以下幾種:(1)C87可能通過誘導細胞生成過量ROS，引起細胞內(nèi)氧化應激及DNA損傷，最終使細胞生長受抑或誘發(fā)凋亡;(2)C87可能通過上調p53蛋白的表達，阻滯細胞周期于G0/G1期，從而抑制細胞生長增殖;(3)C87可能通過破壞線粒體膜電位，使線粒體通透性增加，誘導細胞色素C釋放，啟動Caspase-8，使Caspase-3活化，促進PARP的裂化，最終導致腫瘤細胞發(fā)生