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文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述:
第一部分 組織塊法分離培養(yǎng)小鼠PSC
目的:利用組織塊法分離培養(yǎng)CP模型組和對(duì)照組PSC,并分析兩組分選細(xì)胞的差異。
方法:雨蛙素誘導(dǎo)制備小鼠CP模型,HE染色觀察胰腺纖維化改變;取CP組和對(duì)照組小鼠胰腺組織,胎牛血清清洗,剪切至小米粒大小貼壁培養(yǎng),觀察兩組細(xì)胞及傳代前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異,采用油紅O染色鑒定靜息態(tài)PSC,免疫細(xì)胞化學(xué)/熒光法標(biāo)記α-SMA和Desmin,熒光定
2、量PCR對(duì)比靜息和活化PSCα-SMA和Desmin的mRNA表達(dá)量;利用免疫細(xì)胞化學(xué)/熒光法標(biāo)記胰腺導(dǎo)管細(xì)胞標(biāo)志物CK19和SOX9,及腺泡細(xì)胞標(biāo)志物Chymotrypsin和Amylase。
結(jié)果:(1)HE染色:造模組胰腺發(fā)生纖維化改變,腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化;(2)形態(tài)學(xué)觀察:貼壁4天細(xì)胞多呈類圓形或星形,核周環(huán)繞脂滴,傳代細(xì)胞體積增大,立體感消失,呈“星芒狀”,脂滴消失,CP組細(xì)胞形態(tài)體積小于對(duì)照組;(3)油紅O染色:CP組
3、和對(duì)照組早期細(xì)胞均染色,傳代細(xì)胞未著色;(4)免疫細(xì)胞化學(xué)/熒光:兩組細(xì)胞傳代后,α-SMA和Desmin標(biāo)記均陽(yáng)性,CK19、SOX9、Chymotrypsin、Amylase標(biāo)記均陰性;(5)熒光定量PCR:對(duì)照組傳代細(xì)胞和CP組細(xì)胞α-SMAmRNA含量明顯高于對(duì)照組早期細(xì)胞。
結(jié)論:組織塊法可成功分選CP模型組和對(duì)照組PSC,且兩組貼壁早期細(xì)胞均為靜息狀態(tài)。
第二部分 Erbin及TGF-β1在CP模型組和對(duì)
4、照組PSC中的表達(dá)差異
目的:探討Erbin及TGF-β1在CP模型組和對(duì)照組PSC中的表達(dá)差異
方法:采用雨蛙素腹腔注射法制備CP模型鼠,組織塊法分離提取PSC,運(yùn)用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)比較CP組和對(duì)照組PSC中Erbin及TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)量的差異。
結(jié)果:(1)CP組Erbin表達(dá)較對(duì)照組顯著升高,其轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照組的6.36倍,蛋白水平為對(duì)照組的6.79倍,P<0
5、.05;(2) TGF-β1在CP組中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,其mRNA和蛋白分別為對(duì)照組的3.99倍和1.43倍,P<0.05.
結(jié)論:Erbin和TGF-β1在胰腺纖維化過(guò)程中呈一致性升高,Erbin可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1通路參與胰腺纖維化的發(fā)生。
第三部分 Erbin在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中的表達(dá)
目的:探討TGF-β1誘導(dǎo)PSC活化過(guò)程中是否發(fā)生EMT樣改變及Erbin和TGF-β信號(hào)通路在
6、PSC發(fā)生EMT過(guò)程中的表達(dá)變化。
方法:用10ng/ml TGF-β1刺激貼壁第4天PSC48h,觀察細(xì)胞形態(tài)改變,并采用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TGF-β1處理前后細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、Erbin及TGF-β信號(hào)通路靶點(diǎn)分子的表達(dá)變化。
結(jié)果:(1)TGF-β1處理過(guò)的PSC體積增大,立體感消失,脂滴減少、消失;(2) TGF-β1處理的細(xì)胞E-cadherin mRNA(
7、0.33∶1)和蛋白(0.07∶1)表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),α-SMAmRNA(2.91∶1)和蛋白(3.40∶1)表達(dá)均上調(diào)(P<0.05);(3)熒光定量PCR結(jié)果示,TGF-β1處理細(xì)胞Erbin(13.03倍)、TGF-β1(2.94倍)及其下游的Smad3(2.08倍)和ERK(2.99倍)rnRNA均表達(dá)增加(P<0.05);(4)Western blot結(jié)果示,TGF-β1處理的細(xì)胞Erbin、TGF-β1、Smad3
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