秦皮藥代動力學及秦皮接骨膠囊質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、秦皮是木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance.、白蠟樹Fraxinus Chinensis Roxb.、尖葉白蠟樹Fraxinus szaboana Lingelsh.、宿柱白蠟樹Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮。《中國藥典》(2010版)記載其具有清熱燥濕、收澀、明目的功能，為臨床常用中藥。簡單香豆素是秦皮中的一類主要活性成分，具有抗癌、抗炎、抗病毒的作用。目前

2、對秦皮體內(nèi)藥動學的研究僅限于少數(shù)幾種成分，忽略了中藥多組分的相互協(xié)同作用，難以真實反映秦皮在體內(nèi)的藥動學特征，而秦皮排泄動力學的研究未見報道。同樣，秦皮在體內(nèi)代謝研究多數(shù)集中于單體給藥的代謝研究，且僅研究了幾個成分的代謝物。本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)，研究秦皮中多成分在大鼠體內(nèi)的藥物動力學，并對秦皮在體內(nèi)的代謝物進行鑒定，為秦皮藥效物質(zhì)基礎的闡明提供依據(jù)。
　　秦皮接骨膠囊是一種由秦皮、川貝母、川西

3、小黃菊、龍骨四味中藥組成的藏藥，具有活血散瘀、療傷接骨、止痛的功效，常用于跌打筋骨扭傷、淤血腫痛的治療。本研究建立了一種簡單、快速、靈敏的HPLC-MS/MS方法測定秦皮接骨膠囊中5種化學成分，并對不同批次的秦皮接骨膠囊進行了質(zhì)量分析與評價，為其質(zhì)量控制提供了有效分析方法。
　　第一部分基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的秦皮藥物動力學研究
　　目的:1建立同時測定血漿中9種香豆素類成分的HPLC-MS/MS方法，研究大鼠灌胃給與秦皮提取物后

4、的藥動學特征;2建立測定尿液和膽汁中8種香豆素類成分的HPLC-MS/MS方法，研究其排泄動力學特征。
　　方法:1秦皮提取物的制備:將秦皮粉碎，稱取200 g，加入10倍量水，煎煮提取2h，濾出殘渣，重復提取三次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至100 mL，得到秦皮水提物的濃度為2 g/mL。2血漿、尿液和膽汁樣品的采集與預處理:大鼠灌胃給與秦皮提取物（10 g/kg）后，于不同時間點采集大鼠血漿，生物樣品采用甲醇沉淀蛋白的方

5、法進行預處理。6只大鼠灌胃給與秦皮提取物后置于代謝籠內(nèi)，收集96小時內(nèi)不同時間段的尿液并記錄體積，采用與血漿樣品相同的預處理方法，另外6只大鼠麻醉后進行膽管插管手術(shù)，收集24小時內(nèi)不同時間段的膽汁并記錄體積，用相同的方法進行預處理。3檢測條件:液相色譜柱為Purospher STAR LPRP-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)柱，流動相為0.05％乙酸水-甲醇，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，進樣量10μL。質(zhì)譜檢測采用

6、電噴霧離子源(ESI)，源噴射電壓:5500 V;離子源溫度(TEM):650℃;霧化氣(Gas1):40psi，加熱氣(Gas2):50 psi，簾氣:25 psi;負離子多反應監(jiān)測（MRM）模式。9種待測物的監(jiān)測離子對分別為秦皮甲素m/z339.1/177.0、秦皮乙素m/z177.0/133.0、秦皮苷m/z369.0/207.0、秦皮素m/z207.0/191.9、東莨菪內(nèi)酯m/z191.0/175.9、異東莨菪內(nèi)酯m/z191

7、.0/175.9、6-羥基-7，8-二甲氧基香豆素m/z221.1/159.1、8-羥基-6，7-二甲氧基香豆素m/z221.1/159.1、傘形花內(nèi)酯m/z160.9/133.0。以紫花前胡苷為內(nèi)標。4方法學驗證與藥動學參數(shù)計算:對建立的方法進行方法學驗證，分別考察其專屬性、線性、檢測限、定量限、精密度、準確度、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應、提取回收率以及殘留效應。根據(jù)樣品測定的結(jié)果計算得每個成分每個時間點的濃度，以時間點為橫坐標，濃度為縱坐標，

8、繪制各成分的血藥濃度-時間曲線。并計算每個個體的藥動學參數(shù)，如:血漿濃度-時間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞），最大血漿濃度（Cmax），最大血漿濃度達峰時間（Tmax）和消除半衰期(t1/2)，數(shù)據(jù)由平均值±標準偏差(SD)表示。
　　結(jié)果:1方法學驗證結(jié)果:血漿中9種待測成分的標準曲線在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.9971)，日內(nèi)、日間精密度的相對標準偏差(RSD)小于19.1％，相對誤差(RE)為-10.3％-8

9、.8％，平均提取回收率為74.3％-101.9％;尿液和膽汁樣品測定的日內(nèi)、日間精密度RSD＜14.7％，準確度RE＜13.7％，8種待測成分在4種不同條件下穩(wěn)定性結(jié)果RE＜13.8％，在尿液和膽汁中的提取回收率的范圍為68.6-98.9％。2藥物動力學研究結(jié)果:藥動學參數(shù)表明灌胃給與大鼠秦皮提取物后，各組分吸收迅速，絕大多數(shù)化合物在1h內(nèi)達到最大濃度，而9種化合物在體內(nèi)的消除速率差異較大，苷類化合物消除較快，苷元的消除速度較慢，可能是

10、由于苷在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其苷元。東莨菪內(nèi)酯和異東莨菪內(nèi)酯，6-羥基-7，8-二甲氧基香豆素和8-羥基-6，7-二甲氧基香豆素為兩對同分異構(gòu)體，具有相似的吸收行為，但消除差異較大。大鼠灌胃給與秦皮提取物后，8種化合物在尿中32h內(nèi)基本排泄完全，在膽汁中18h內(nèi)基本排泄完全。大多數(shù)香豆素以原型在尿液中的排泄量小于10％，而秦皮乙素以原型在尿液中的排泄量達到19.26％，可能是由于大量秦皮甲素在體內(nèi)代謝為秦皮乙素。8種香豆素在膽汁中的排泄量均小于2

11、％，說明各成分以原型在大鼠膽汁中排泄率不高。
　　結(jié)論:本研究建立了HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿、尿液和膽汁中的簡單香豆素，該方法簡單、快速、靈敏度高、專屬性強，適用于秦皮在大鼠體內(nèi)的藥物動力學研究。對秦皮中香豆素類成分的排泄動力學特征以及6種香豆素（秦皮苷、秦皮素、異東莨菪內(nèi)酯、6-羥基-7，8-二甲氧基香豆素、8-羥基-6，7-二甲氧基香豆素和傘形花內(nèi)酯）在血漿中的藥動學特征屬首次研究。
　　第二部分 HPLC-Q

12、T0F-MS/MS技術(shù)鑒定秦皮中成分在大鼠血漿、尿液、膽汁中的代謝物
　　目的:建立靈敏、有效的HPLC-QTOF-MS/MS方法，用于鑒定大鼠血漿、尿液和膽汁中秦皮成分的代謝物。
　　方法:取SD雄性大鼠9只，分別按10 g/kg灌胃給與秦皮提取物，3只用于分段收集給藥后72 h內(nèi)的尿液，3只用于采集12 h內(nèi)不同時間點的血漿樣品，3只用于分段收集膽管插管后24 h時間段的膽汁。生物樣品采用3倍乙酸乙酯萃取3次，合并上清液

13、蒸干后，甲醇復溶。色譜柱:Purospher STAR LP RP-C18(250 mm×4.6 mm，5μn)，柱溫:25℃，流動相:甲醇(A)-0.05％乙酸水溶液(B)，梯度洗脫，洗脫程序如下:0-5 min，5-20％(A);5-20 min,20％(A);20-40min,20-40％(A);40-75 min,40-95％(A)，預平衡10 min，柱溫:30℃，流速:1.0 mL/min，進樣量10μL。采用HPLC-QT

14、OF-MS/MS技術(shù)進行TOF-MS-IDA-8MS/MS掃描，分別在正離子模式和負離子模式下進行數(shù)據(jù)采集，并用Peak View2.0以及Metabolite pilot1.5等軟件進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)秦皮中簡單香豆素類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并結(jié)合母藥可能的代謝途徑推測其可能的代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)果:本研究共鑒定出秦皮在大鼠體內(nèi)的化合物39個，其中血漿中22個，尿液中36個，膽汁中24個。39個化合物中，原型化合物13個，代謝產(chǎn)物26

15、個。
　　結(jié)論:本法靈敏、有效，可成功應用于大鼠灌胃給與秦皮水提物后，尿液、血漿、膽汁中的代謝物結(jié)構(gòu)鑒定。本實驗對于闡明秦皮在體內(nèi)的藥效機制具有十分重要的意義。
　　第三部分秦皮接骨膠囊質(zhì)量控制方法研究
　　目的:建立一種HPLC-MS/MS方法同時測定秦皮接骨膠囊中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、貝母甲素、貝母乙素5種化學成分，并用于秦皮接骨膠囊的質(zhì)量控制。
　　方法:1樣品提取方法的考察:對直接超聲提取和堿化后氯

16、仿-甲醇回流提取兩種方法分別進行了條件優(yōu)化，并對最優(yōu)條件下的樣品提取結(jié)果進行了比較。直接超聲提取方法分別優(yōu)化了超聲時間(30 min，45 min，60 min，75 min，90 min)、提取水溶液中甲醇比例(25％，50％，75％，100％)。堿化氯仿-甲醇回流提取法采用四因素三水平的正交試驗進行條件優(yōu)化，四因素三水平包括:堿化時間(A)，水平(30 min，60 min，120 min);甲醇和氯仿比例(B)，水平(1∶1，1∶

17、2，1∶4);提取溶液的體積(C)，水平(25 mL，50 mL，75mL);提取時間(D)，水平(30min，60 min，90 min)。2測定條件:色譜柱為Purospher STAR LP RP-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈-0.3‰甲酸水溶液，梯度洗脫，分析時間13 min，質(zhì)譜檢測采用多反應監(jiān)測(MRM)模式，ESI源，正、負離子切換模式，源噴射電壓分別為5500 V和-4500 V，離子源溫度

18、為650℃。3方法學驗證和樣品測定:對所建立的方法進行方法學驗證，分別考察方法的線性、范圍、檢測限、定量限、精密度、準確度和溶液穩(wěn)定性，并采用驗證的方法對3批秦皮接骨膠囊進行測定，比較不同批次間秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、貝母甲素、貝母乙素5種化學成分的含量差異，用于秦皮接骨膠囊的質(zhì)量評價。
　　結(jié)果:1樣品提取方法:比較甲醇超聲提取和氯仿-甲醇回流提取的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用兩種提取方法，貝母甲素和貝母乙素含量沒有顯著差異，而秦皮甲素、

19、秦皮乙素和秦皮苷含量在采用超聲提取時顯著增加。此外，甲醇超聲提取的方法簡單、快速、易操作，因此選擇甲醇超聲提取的方法。
　　2方法學驗證:秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、貝母甲素、貝母乙素5種化學成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(r2≥0.9977)，儀器重復性相對標準偏差(RSD)小于4.8％，日內(nèi)和日間精密度的相對標準偏差分別小于7.4％和2.5％?；厥章史秶鸀?9.7-121.4％，RSD小于10.8％。3

20、樣品測定結(jié)果:秦皮甲素、秦皮乙素和秦皮苷為秦皮的主要化合物。其中，秦皮甲素的含量最高，其次是秦皮苷，其含量測定結(jié)果平均值分別為7.96μg/g和6.18μg/g。秦皮乙素為4.48μg/g，比前兩者含量較低。另一方面，貝母甲素和貝母乙素的含量相對較低，其中貝母乙素的含量(0.08μg/g)最低。此外，秦皮甲素、貝母甲素和貝母乙素在不同批次中含量沒有顯著的變化，不同批次相對標準偏差低于10％。秦皮乙素和秦皮苷的含量差異較大，批間差異RSD