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文檔簡介
1、最初,研究人員在植物中發(fā)現(xiàn)Argonaute(AGO)蛋白是發(fā)育調(diào)節(jié)因子,后來進一步發(fā)現(xiàn)它們是RNA沉默中的核心分子、它與小的非編碼RNAs(siRNA,miRNA,piRNA)生物發(fā)生和細胞功能密切相關(guān),它可以結(jié)合小RNAs,調(diào)控蛋白質(zhì)的合成或影響mRNA的穩(wěn)定性,即RNA干擾(RNAi)技術(shù)。Argonaute(AGO):是一個高度保守的家族,這一蛋白家族包括許多成員,同時,不同的AGO蛋白有著不同的生物學(xué)功能。由于在人體細胞內(nèi)敲除
2、ago3后不能降解目標(biāo)mRNA、抑制蛋白表達,另外轉(zhuǎn)入的ago3基因在人體細胞中很難穩(wěn)定表達,所以對人體Ago3的功能還不清楚。本實驗通過RNA干擾技術(shù)和轉(zhuǎn)染外源ago3表達質(zhì)粒的方法調(diào)控人體細胞中Ago3的下調(diào)和上調(diào),從而研究、探討Ago3蛋白的功能。本文首先介紹了RNAi干擾技術(shù),接著又詳細介紹了Argonaute蛋白家族及其功能。
利用不同的轉(zhuǎn)染方法將具有熒光標(biāo)記的si-ago3、 c-flag-ago3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MC
3、F7、Hela、HEK293細胞中;培養(yǎng)24h后,倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果,選擇最佳轉(zhuǎn)染條件;RT-PCR檢測si-ago3、flag-ago3介導(dǎo)的細胞中ago3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化;蛋白印跡法(Western blotting)法檢測外源導(dǎo)入的flag-ago3質(zhì)粒能否在HEK293細胞中成功表達;MTT法繪制質(zhì)粒si-ago3轉(zhuǎn)入HEK293細胞24h、48h、72h的生長曲線;流式細胞儀進一步測定si-ago3和c-fla
4、g-ago3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48后,Ago3蛋白不同表達水平對HEK293細胞周期產(chǎn)生的影響;免疫熒光法定位Ago3蛋白。
經(jīng)過Western blotting驗證,表明采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法可以使外源ago3基因在HEK293細胞內(nèi)成功表達,通過RNAi干擾技術(shù)下調(diào)Ago3可以抑制HEK293細胞的正常生長,使G0/G1期受阻滯,而過度表達Ago3會加快細胞從G1期進入S期,說明一定量的Ago3蛋白是HEK293細胞正常生長所必不可
5、少的,其過多或過少表達都會影響細胞G1/S期的進程對生長造成影響。RT-PCR,檢測在細胞周期中調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換過程的cyclin D1、p161NK4a基因在Ago3缺失、過量表達導(dǎo)致細胞周期變化過程中的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示Ago3蛋白不同的表達水平直接影響了細胞周期蛋白cyclinD1的生物合成,間接的調(diào)控了細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化進程,從而影響細胞的增殖。而P16基因在細胞周期變化過程中并沒有明顯的改變,因此還有待于進一步研究。最后
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