醛縮酶B在索拉非尼治療肝癌的耐藥作用研究.pdf

1、研究目的:原發(fā)性肝細(xì)胞癌（以下簡稱，肝癌）是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率極高。其主要原因之一是肝癌病人門靜脈癌栓(以下簡稱PVTT)發(fā)生率很高，50％-60％的肝癌病人首診時通過影像學(xué)檢查就會發(fā)現(xiàn)有門靜脈癌栓。PVTT可導(dǎo)致肝癌病人門靜脈壓力升高、肝功能惡化、肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等。因此研究肝癌伴門靜脈癌栓發(fā)生的防治策略及早期診斷是臨床提高肝癌病人整體療效的當(dāng)務(wù)之急。
　　晚期肝癌的治療中索拉非尼是當(dāng)今世界公認(rèn)的

2、最為有效的藥物，巴塞羅那分期中明確指出中晚期(BCLC∶C)患者推薦使用索拉非尼。但隨著索拉非尼的臨床應(yīng)用卻發(fā)現(xiàn)許多臨床耐藥的現(xiàn)象。引起臨床耐藥的原因有很多，既往以腫瘤干細(xì)胞、基因突變等角度解釋其耐藥機(jī)制，但仍有很多局限。任何基因或狀態(tài)的改變最終都會反映在代謝產(chǎn)物上。因而代謝組學(xué)是繼蛋白組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后一門新興學(xué)科，是組學(xué)的最終方向。也逐漸成為了腫瘤耐藥研究的熱點。
　　因此，將通過代謝組學(xué)技術(shù)揭示肝癌代謝重構(gòu)規(guī)律，尋找引起代謝

3、重構(gòu)的關(guān)鍵基因，進(jìn)而研究目的基因與索拉非尼敏感性關(guān)系，為臨床用藥提供指導(dǎo)。
　　研究方法:
　　1、通過對臨床配對肝癌相關(guān)的（非癌-原位癌-癌栓）組織原代培養(yǎng)，并利用13C穩(wěn)定同位素示蹤實驗技術(shù)觀察配對組織中代謝流量變化，揭示肝癌PVTT的發(fā)生發(fā)展中代謝重構(gòu)特點。
　　2、對比臨床配對肝癌相關(guān)的（非癌-原位癌-癌栓）組織的基因芯片篩選代謝相關(guān)基因，并通過Western blot蛋白免疫印跡和免疫組化實驗驗證。確定目的基

4、因為ALDOB。
　　3、構(gòu)建pGFP-ALDOB嘌呤霉素抗性質(zhì)粒通過慢病毒包裝轉(zhuǎn)染Huh-7、MHCC-LM3及CSQT-2肝癌細(xì)胞，并通過抗性篩選得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　4、以過表達(dá)ALDOB的肝癌細(xì)胞系為基礎(chǔ)，通過13C穩(wěn)定同位素示蹤實驗技術(shù)觀察ALDOB及Sorafenib對代謝重構(gòu)的影響。
　　5、以過表達(dá)ALDOB的肝癌細(xì)胞系為基礎(chǔ)，利用CCK8實驗研究ALDOB及Sorafenib對增殖能力;應(yīng)用Trans

5、well遷移、侵襲實驗研究ALDOB及Sorafenib對肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力等生物學(xué)功能的影響。
　　6、購買部分免疫缺陷裸鼠，構(gòu)建裸鼠皮下荷瘤模型觀察ALDOB及Sorafenib對荷瘤能力;構(gòu)建裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型觀察ALDOB及Sorafenib對轉(zhuǎn)移能力等體內(nèi)的生物學(xué)影響。
　　7、收集臨床術(shù)后服用Sorafenib的肝癌患者組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察ALDOB的表達(dá)情況。
　　8、回顧性分析ALDOB

6、的表達(dá)對服用Sorafenib肝癌患者的預(yù)后影響。
　　結(jié)果:
　　1、臨床配對肝癌相關(guān)的（非癌-原位癌-癌栓）組織的代謝重構(gòu)特點，結(jié)合臨床配對肝癌相關(guān)的（非癌-原位癌-癌栓）組織的基因芯片篩選及臨床配對肝癌組織樣本驗證，發(fā)現(xiàn)在肝癌的發(fā)生發(fā)展（非癌-原位癌-癌栓）過程中ALDOB逐漸下降。
　　2、ALDOB過表達(dá)及應(yīng)用Sorafenib對肝癌細(xì)胞的代謝水平發(fā)生了明顯的變化，提示:ALDOB是肝癌發(fā)生發(fā)展中調(diào)節(jié)糖代謝重

7、構(gòu)的關(guān)鍵基因。ALDOB對Sorafenib用藥前后代謝改變趨勢相反。
　　3、ALDOB過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用Sorafenib，下降了藥物對腫瘤的抑制效果。提示;ALDOB是肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因。ALDOB下降了Sorafenib對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
　　4、ALDOB抑制了Sorafenib對腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的下調(diào)。
　　5、ALDOB減少了Sorafenib對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生ROS的抑