雞敗血支原體黏附素GapA的表達(dá)及基因靶向載體的構(gòu)建.pdf

1、雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)能引起雞及其它禽類的慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease，CRD)和火雞傳染性竇炎(Infectioussinusitis)，該病廣泛分布于世界上所有養(yǎng)禽的國家，且常繼發(fā)或并發(fā)新城疫、傳染性支氣管炎等其他呼吸道傳染病，造成巨大的經(jīng)濟損失。 MG感染和寄生最重要的步驟是牢固地黏附在呼吸道黏膜固有層。因此，為了深入研究MG致病機

2、制，本研究對MG主要黏附素GapA的相關(guān)免疫特性進行探索，并成功構(gòu)建MG通用型轉(zhuǎn)座載體和oriC可復(fù)制型載體用于MG基因靶向缺失研究。 1、雞敗血支原體強弱毒株gapA基因的克隆及序列測定 本研究通過RT-PCR和PCR擴增MG不同毒力毒株的gapA基因N端序列，測定各基因片段序列，并比較其在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和序列之間的差異性。結(jié)果表明：gapA基因存在于一個大型的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，與licA，mgc2、crmA三個

3、基因同在一個基因簇中；不同毒株之間，gapA基因N端存在明顯的差異，GapA的90～290aa之間即為GapA的高變區(qū)(圖1-9、圖1-10)。而對于Rhigh，常出現(xiàn)在多個位置插入有單一“A”的現(xiàn)象，如：第105位、385位和910位，導(dǎo)致隨后的基因序列移碼成TAA終止子，致使翻譯提前終止；而對于ts-11株，gapAN端的第142nt處由“C”突變?yōu)椤癆”，形成TAA密碼子，致使翻譯提前終止。而強毒株Rlow、S6、DC9604和弱

4、毒株F、6/85均能編碼gapA基因全長，編碼大約110～120kD左右的蛋白。這幾個毒株之間的區(qū)別在于：GapA的N端100-300aa之間存在高變區(qū)。這為GapA的表達(dá)和抗體制備奠定了基礎(chǔ)。 2、雞敗血支原體Rlow株GapA氨基端(GapAN)的高效表達(dá) 本研究通過PCR擴增GapA蛋白N端多肽(98~322aa)(GapAN)和C端(882aa-1115aa)，分別連入pGEX-6P-1載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3

5、)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GapAN獲得高效表達(dá)；而GapA C端未能成功表達(dá)。將GapAN亞克隆入pFAST-Bacl載體中，轉(zhuǎn)座DH10Bac細(xì)菌，通過轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得GapAN的重組桿狀病毒。抗GapAN的多抗利用IFA檢測，結(jié)果顯示：GapAN成功地在桿狀病毒中高效表達(dá)。 3、雞敗血支原體GapAN單抗制備 利用GapAN的原核表達(dá)產(chǎn)物免疫Balb/c小鼠，并利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GapAN

6、進行篩選，成功制備獲得5株抗GapAN特異性單抗(185、1D7、3D4、483、5B10)。對單抗的免疫特性研究發(fā)現(xiàn)：單抗5810株可以檢測強弱毒株表達(dá)差異的GapA，表明該毒株極可能針對GapAN的高變區(qū)；3D4株出現(xiàn)熒光陽性效價，且其WB反應(yīng)性最強，雖然不能區(qū)分強弱毒株，但該單抗可以用于GapA的常規(guī)表達(dá)鑒定；其余單抗的反應(yīng)特異性不強，也在WB反應(yīng)中出現(xiàn)多個條帶。這-研究為GapA的功能研究及缺失篩選研究提供了必要的工具。

7、 4、通用型轉(zhuǎn)座載體mini-Tn4001tetM構(gòu)建 為了方便黏附素GapA等功能基因的研究工作，本研究根據(jù)轉(zhuǎn)座子原理成功構(gòu)建了MG的通用型轉(zhuǎn)座載體：mini-Tn4001tetM。該轉(zhuǎn)座載體包含有外置的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座酶基因(tnp)和IS256重復(fù)序列(含Inner和Outer)，篩選基因為糞腸球菌Tn916轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素抗性基因tetM。本研究對篩選基因、啟動子進行了改造，置換了lacZ基因和MG tuf啟動子等元件。

8、電轉(zhuǎn)化的初步結(jié)果顯示：該轉(zhuǎn)座載體可以在MG中連續(xù)傳代。對插入?yún)^(qū)域和轉(zhuǎn)座的穩(wěn)定性鑒定工作正在進行中。 5、雞敗血支原體oriC復(fù)制型載體構(gòu)建 根據(jù)MG假定的oriC區(qū)域，設(shè)計不同引物擴增MG不同大小的oriC片段，分為：Long oriC(LoriC)、Short oriC(SoriC)和Whole oriC(WoriC)。分別將片段插入到pBlueScript SK(+)載體中，并插入含有Tn916四環(huán)素抗性基因(tet