雞敗血支原體mga0553編碼基因功能的初步鑒定.pdf

1、雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是引發(fā)雞慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease，CRD)和火雞傳染性竇炎(Infectious sinusitis)的病原體，給家禽生產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。M. gallisepticum是介于細(xì)菌與病毒之間的一類基因組最小，并能自我繁殖的原核生物。其中強(qiáng)毒株Rlow全基因組序列長(zhǎng)996422bp，含742個(gè)獨(dú)立編碼區(qū)(CDSs)。目

2、前尚有150個(gè)保守的假定蛋白和123個(gè)假定蛋白的功能未被確定，尤其是對(duì)MG的致病性起著重要作用的膜相關(guān)蛋白及毒力因子。 本研究設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上下游分別加入BamH I和Sal I限制性酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR方法將MG全基因組序列中的一個(gè)預(yù)測(cè)為未知蛋白的編碼基因mga0553進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物連接pGEM-T easy載體，進(jìn)行克隆和測(cè)序。運(yùn)用DNAStar軟件將目的基因預(yù)測(cè)蛋白氨基酸序列與Rlow株進(jìn)行比較，分析發(fā)現(xiàn)：該蛋白為保守

3、蛋白，R(F94)、S6、F36三株的MGA_0553僅有10個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，但疏水區(qū)及α螺旋區(qū)分布未產(chǎn)生明顯變化。將S6株的預(yù)測(cè)蛋白MGA_0553氨基酸序列提交SWISS—Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，分析結(jié)果顯示：MGA_0553共包含376個(gè)氨基酸，帶陰性電荷氨基酸(Asp+Glu)38個(gè)，陽(yáng)性電荷氨基酸(Arg+Lys)44個(gè)；等電點(diǎn)為8.95，分子量為42kDa。采用DAS(Dense Alignment Surface)方法對(duì)該預(yù)測(cè)

4、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明：在N38-55位是一個(gè)跨膜區(qū)。用SignalP 3.0進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果顯示：該蛋白N1-50位可能是一個(gè)信號(hào)肽。綜合分析結(jié)果表明：MGA_0553可能是MG的一種分泌蛋白成分。 將經(jīng)BamH I、Sal，I雙酶切的mga0553連接pET-32a(+)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE31細(xì)菌的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，目的基因被低效率地以包涵體形式表達(dá)。SDS-PAGE分離目的蛋白條帶，切膠免疫ICR小鼠制備

5、特異性抗體，Western-blot檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白證實(shí)MGA 0553具有較強(qiáng)的免疫原性。以表達(dá)產(chǎn)物的抗血清為一抗， FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)S6、F36株菌體蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩株菌體細(xì)胞均呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光。S6株菌體細(xì)胞在分別含有鼠抗MGA_0553和S6全菌抗血清的Frey’s液體培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示：菌體細(xì)胞在含有抗MGA_0553血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)率為6×10<'-2>％，在含