協(xié)同刺激分子B7-H4通過活化IL-6-STAT3信號通路促進食管鱗狀細胞癌形成.pdf

1、第一部分 B7-H4在小鼠食管癌前病變進程中的表達
　　目的：食管鱗狀細胞癌（esohaphageal squamous cell carcinoma, ESCC）是嚴重威脅人類生命及健康的癌癥之一。由于大部分患者在確診時已是中晚期，沒有顯著有效的治療措施，ESCC的預后一直較差，5年生存率約為20％。食管癌前病變是正常食管向ESCC轉變過程中的一種組織病理異常。如果接受恰當?shù)脑\斷和治療，食管癌前病變預后較好，5年生存率可超過90

2、%。因此，預防和治療食管癌前病變是降低ESCC發(fā)病率和致死率的重要措施。協(xié)同刺激分子B7-H4是B7家族重要成員，在多種腫瘤組織中高表達，并與預后呈負相關。為了研究食管癌前病變的發(fā)病機制，探討B(tài)7-H4在食管癌前病變進程中的作用，本文擬采用4NQO飲水法誘導建立小鼠食管癌前病變模型，觀察食管癌前病變自然進程中的組織病理改變，研究 B7-H4在小鼠食管癌前病變形成過程中的表達變化，及與腫瘤微環(huán)境中的相關淋巴細胞和細胞因子表達的關系，為評價

3、其能否成為食管癌前病變診斷和治療的新靶標奠定基礎。
　　方法：
　　1通過4NQO飲水法誘導小鼠食管癌前病變模型，觀察病變過程中小鼠一般狀態(tài)及體重變化，并通過HE染色法評價食管癌前病變自然進程中食管組織的病理改變。
　　2通過免疫組織化學染色技術評價小鼠食管癌前病變自然進程中B7-H4在食管上皮細胞的表達，以及 CD4+T、CD8+T、CD11b+巨噬細胞在食管上皮組織的浸潤，并分析 B7-H4表達與淋巴細胞浸潤之間的

4、相關性。
　　3通過qPCR、Western blot和ELISA方法檢測食管癌前病變進程中B7-H4、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ、total STAT3和p-STAT3的表達，并分析其相關性。
　　4通過ELISA和Western blot方法檢測小鼠食管癌前病變進程中血清B7-H4（sB7-H4）和鱗狀細胞癌抗原-2（SCCA-2）的表達，并分析其與病變程度的相關性。
　　結果：
　　1小鼠

5、體重變化
　　誘癌前，小鼠狀態(tài)良好。隨著誘癌時間的延長，對照組動物狀態(tài)良好，飲食飲水正常，4NQO小鼠飲食飲水逐漸減少，一般狀態(tài)逐漸變差。另外，對照組小鼠體重增長正常。而與對照組相比，4NQO誘癌組動物體重增長緩慢，特別是在17周之后，4NQO誘癌組雌性和雄性動物體重均逐漸降低，而且分別顯著低于對照組雌性和雄性動物體重。
　　2小鼠食管組織病變特點
　　從誘癌16周至28周，4NQO誘癌組小鼠食管組織出現(xiàn)肉眼可見的不同

6、程度的病理改變，包括上皮組織增厚，表面粗糙、凹凸不平，及腫塊。隨著誘癌時間的延長，病變程度逐漸增加。
　　3 HE染色評價食管組織病理改變
　　在整個誘癌過程中，4NQO誘癌小鼠食管組織經(jīng)歷了從正常食管、低級別上皮內(nèi)瘤變（LGIN）至高級別上皮內(nèi)瘤變（HGIN）的病理改變過程。小鼠食管組織病理改變與誘癌時間呈顯著正相關，χ2=33.5476, P<0.0001。另外，Kruskal-Wallis分析結果表明，雌雄小鼠食管組織

7、病理改變無顯著差異，P>0.05。
　　4免疫組化檢測B7-H4及淋巴細胞表達變化
　　B7-H4表達于上皮細胞的胞漿和胞膜。根據(jù)評分結果，22例正常食管組織只有2例B7-H4高表達（9.1%）。食管癌前病變組織中，27例LGIN食管組織有11例B7-H4高表達（40.7%），21例HGIN食管組織有17例B7-H4高表達（81.0%）。Spearman相關性分析表明，B7-H4表達與病理級別呈顯著正相關（ P<0.0001

8、），而與小鼠性別無顯著相關性（ P=0.2959）。
　　CD4、CD8和CD11b分別是CD4+T, CD8+T和巨噬細胞表面表達的膜分子。三種淋巴細胞主要浸潤于食管上皮組織的粘膜下層，而在粘膜層浸潤較少。另外，B7-H4表達與CD11b巨噬細胞在粘膜下層的浸潤呈顯著正相關（P=0.0002），而與CD4+T和CD8+T浸潤無顯著相關性（P=0.8507，P=0.3166）。
　　5 qPCR檢測B7-H4及相關細胞因子和

9、STAT3表達
　　與對照組相比，隨著誘癌時間的延長，4NQO小鼠食管組織B7-H4、IL-6、IL-10、TGF-β基因表達逐漸提高，特別是26周和28周，上述基因表達顯著提高，且均具有顯著性差異。另外，通過Spearman相關性分析， B7-H4與IL-6（r=0.5952，P<0.0001），IL-10（r=0.6561，P<0.0001）， TGF-β（r=0.6586，P<0.0001）呈顯著正相關。然而，IFN-γ和S

10、TAT3基因表達升高不明顯。
　　6 Western blot和ELISA法檢測B7-H4與相關蛋白表達
　　與對照組比較，隨著誘癌時間的延長，4NQO誘癌組小鼠食管組織B7-H4和IL-6蛋白表達逐漸提高，特別是26周和28周，兩種蛋白提高具有顯著性差異，P<0.05，P<0.01。另外，與對照組相比，4NQO誘癌組小鼠食管組織28周p-STAT3表達顯著提高，P<0.01。另一方面，在整個誘癌過程中，B7-H4的表達與I

11、L-6或p-STAT3的表達呈顯著正相關，（r=0.6145，P<0.0001； r=0.6180，P<0.0001）?？傊?，結果表明，在小鼠食管癌前病變形成的過程中，B7-H4表達與IL-6/STAT3信號通路活化呈正相關。
　　7 Western blot和ELISA法檢測sB7-H4及SCCA-2蛋白表達
　　與正常小鼠相比，HGIN小鼠血清中sB7-H4及SCCA-2蛋白濃度顯著提高，P<0.05，P<0.05。結果

12、提示，sB7-H4與SCCA-2蛋白相似，可能成為食管癌及癌前病變潛在的腫瘤標志物。
　　第二部分B7-H4活化IL-6/STAT3通路并促進食管鱗狀細胞癌細胞增殖
　　目的：
　　為了進一步研究 B7-H4參與食管癌前病變形成的作用機制，以及其表達改變對 IL-6/STAT3信號通路的作用，本部分內(nèi)容研究了 B7-H4對Eca109、TE1和 TE13三種 ESCC細胞生物學功能的影響，以及其與IL-6/STAT3信

13、號通路活化之間的關系。
　　方法：
　　1 MTS細胞增殖實驗
　　收集空白對照和敲低B7-H4的ESCC細胞，接種于96孔板，在接種后的0 h、24 h、48 h、72 h，每孔加入20μl MTS染色液，用酶標儀在490 nm測定吸光度值，檢測細胞的增殖率。
　　2克隆形成實驗
　　收集空白對照和敲低B7-H4的ESCC細胞，接種入3cm直徑的培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)12天，計數(shù)細胞克隆數(shù)。
　　3流式細

14、胞術檢測細胞周期
　　收集空白對照和敲低B7-H4的ESCC細胞，通過PI染色，用流式細胞儀檢測DNA含量分布，分析細胞周期特點。
　　4流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　收集空白對照和敲低B7-H4的ESCC細胞，通過Annexin-Ⅴ和7-AAD染色，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡特點。
　　5 qPCR和Western blot、ELISA法檢測B7-H4及相關分子表達
　　收集空白對照和敲低B7-H4的ESC

15、C細胞，通過qPCR和Western blot方法檢測B7-H4、IL-6、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、Bcl-2、BAX和Survivin的表達。
　　6免疫熒光染色和Western blot檢測total STAT3和p-STAT3在胞漿和胞核的定位
　　收集空白對照和敲低B7-H4的ESCC細胞，通過免疫熒光染色技術觀察total STAT3和p-STAT3在細胞漿和細胞核的分布。收集空白對照和

16、敲低B7-H4的ESCC細胞，分別提取細胞漿和細胞核的蛋白，通過Western blot方法檢測total STAT3和p-STAT3在細胞漿和細胞核的表達。
　　7 AG490對B7-H4沉默抑制IL-6分泌的作用
　　將40μM AG490（JAK2/STAT3抑制劑）處理的細胞，轉染control shRNA或B7-H4 shRNA，48 h后收集上清液，通過ELISA方法檢測細胞上清液IL-6濃度。
　　8 T

17、ocilizumab對B7-H4沉默抑制JAK2/STAT3活化的作用
　　將200 ng/ml Tocilizumab（IL-6受體阻斷劑）處理的細胞轉染control shRNA或B7-H4 shRNA，48 h后收集細胞，通過Western blot方法檢測total JAK2、 p-JAK2、total STAT3、p-STAT3的蛋白表達。
　　結果：
　　1 B7-H4在ESCC細胞高表達
　　Eca

18、109、TE1和TE13均為ESCC細胞。其中，Eca109和TE13為高分化，TE13為低分化。B7-H4在人正常食管組織幾乎不表達。與正常食管組織相比，B7-H4在Eca109、TE1和TE13三種細胞均高表達，而且， B7-H4在Eca109、TE1和TE13表達水平相似，無顯著性差異，P>0.05。
　　2 B7-H4沉默抑制細胞增殖及克隆形成
　　MTS實驗結果表明，與control shRNA處理組相比，B7-H

19、4 shRNA處理的Eca109、TE1和TE13細胞在接種后48 h和72 h增殖率都顯著降低?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，與control shRNA處理細胞相比，B7-H4沉默可顯著降低Eca109、TE1和TE13細胞的克隆數(shù)，P值分別為<0.05，<0.001，<0.001。
　　3 B7-H4對ESCC細胞周期的影響
　　與空白對照細胞相比，B7-H4 shRNA處理的 Eca109、TE1和 TE13細胞G1期比例顯

20、著提高，P值均為<0.05，而S期和G2期比例有一定程度的降低，但無顯著性差異, P值均>0.05。
　　4 B7-H4對ESCC細胞凋亡的影響
　　與空白對照相比，B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細胞總凋亡率顯著提高，P<0.001，<0.01，和<0.05。另外，與空白對照相比，B7-H4敲低的細胞早期凋亡和晚期凋亡率也分別有一定程度的提高，P<0.05或P<0.01。
　　5 B7-H4對ESCC細

21、胞凋亡相關分子表達的影響
　　與空白對照相比，B7-H4低表達的ESCC細胞表現(xiàn)為顯著的凋亡抑制分子Bcl-2和Survivin表達下調(diào)，以及凋亡促進分子BAX的表達上調(diào)，P<0.01或P<0.001。
　　6 B7-H4對ESCC細胞IL-6分泌的影響
　　與空白對照相比，B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細胞上清液IL-6濃度顯著降低，P<0.05，P<0.01，或P<0.01。
　　7 B7-H

22、4對JAK2、STAT3活化的影響
　　與空白對照相比，B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細胞總STAT3的表達無顯著差異，而p-STAT3（STAT3的活化形式）的表達顯著降低， P均<0.001。另外，B7-H4沉默可顯著降低Eca109、TE1和TE13細胞p-JAK2的表達，而對總JAK2表達無影響，P<0.01，P<0.05，P<0.01。由此可知，B7-H4在JAK2/STAT3信號通路活化中起重要作用。<

23、br>　　8 B7-H4對STAT3和p-STAT3核漿轉位的影響
　　B7-H4敲低后可顯著降低p-STAT3在Eca109、TE1和TE13細胞核的表達（P<0.01，P<0.05，P<0.05），而對其在細胞漿的表達無顯著影響，P均>0.05。另外，B7-H4敲低對總STAT3在細胞漿及細胞核的表達均無顯著影響，P均>0.05。
　　9 AG490阻斷了B7-H4敲低對IL-6分泌的抑制作用
　　與空白對照細胞相

24、比，B7-H4 shRNA處理的 Eca109、TE1和TE13細胞IL-6分泌顯著降低，P<0.01，P<0.01，P<0.001。而與control shRNA和AG490合用處理組相比，B7-H4 shRNA和AG490處理的Eca109、TE1和TE13細胞IL-6分泌無顯著差異，P均>0.05。上述結果提示B7-H4敲低是通過抑制STAT3的活化進而抑制IL-6的分泌。
　　10 Tocilizumab不能阻斷B7-H4

25、敲低對JAK2/STAT3活化的抑制作用與空白對照細胞相比，B7-H4 shRNA處理的 TE13細胞 p-JAK2和p-STAT3表達顯著降低， P<0.05， P<0.05。與 control shRNA和Tocilizumab單獨處理組相比，B7-H4 shRNA與Tocilizumab處理的TE13細胞p-JAK2和p-STAT3表達也顯著降低，P<0.05，P<0.05。結果提示無論是否存在IL-6， B7-H4敲低均直接抑制

26、了JAK2/STAT3的活化。
　　第三部分IL-6促進食管鱗狀細胞癌細胞增殖及與B7-H4表達的關系
　　目的：
　　為了進一步闡明B7-H4促進IL-6分泌是否是B7-H4促進ESCC細胞增殖的分子機制，以及B7-H4的表達是否受IL-6的影響，本部分內(nèi)容研究了IL-6促進ESCC細胞增殖的作用及與B7-H4分子表達的關系。
　　方法：
　　1 IL-6對ESCC細胞增殖的影響
　　收集Eca10

27、9、TE1和TE13細胞，以4000個細胞/孔接種入96孔板，分別加入含0、10、20、40 ng/ml IL-6蛋白的培養(yǎng)基，通過MTS實驗檢測細胞的增殖能力。
　　2 Tocilizumab對ESCC細胞增殖的影響
　　收集control shRNA和B7-H4 shRNA處理的Eca109、TE1和TE13細胞，以4000個細胞/孔分別接種入96孔板，用含或不含Tocilizumab（200 ng/ml）培養(yǎng)基培養(yǎng)。通

28、過MTS和克隆形成實驗檢測細胞的增殖和克隆形成能力。
　　3 IL-6對ESCC細胞B7-H4表達的影響
　　收集Eca109、TE1和TE13細胞，分別加入含或不含40 ng/ml IL-6蛋白的培養(yǎng)基孵育48 h。收集細胞，通過Western blot方法檢測B7-H4表達。
　　4 Tocilizumab對ESCC細胞B7-H4表達的影響
　　收集Eca109、TE1和TE13細胞，以5×105細胞/孔接種

29、入6孔板，分別加入含或不含200 ng/ml人IL-6受體阻斷劑Tocilizumab的培養(yǎng)基孵育48 h。收集細胞，通過Western blot方法考察B7-H4表達。
　　結果：
　　1 IL-6不能促進ESCC細胞增殖
　　與空白對照組相比，10、20和40 ng/ml的IL-6處理的Eca109、TE1和TE13細胞增殖率無明顯差異，P均>0.05。
　　2 Tocilizumab抑制ESCC細胞增殖及克

30、隆形成
　　200 ng/ml的Tocilizumab可顯著抑制Eca109、TE1和TE13細胞增殖率和克隆數(shù)。
　　3 Tocilizumab不能抑制B7-H4敲低的ESCC細胞增殖及克隆形成
　　與 B7-H4敲低單獨處理的細胞相比，200 ng/ml的 Tocilizumab對B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細胞增殖率和克隆數(shù)無顯著影響，P均>0.05。
　　4 IL-6不能誘導ESCC細胞

31、B7-H4的表達
　　40 ng/ml IL-6對Eca109、TE1和TE13細胞B7-H4的表達無影響，P均>0.05。
　　5 Tocilizumab抑制ESCC細胞B7-H4的表達
　　與正常ESCC細胞相比，Tocilizumab可顯著降低B7-H4在Eca109、TE1和TE13細胞的表達，P分別為<0.05，<0.001和<0.01。
　　結論：
　　14NQO飲水法可成功誘導小鼠食管癌前病變